UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

NAIALY FERNANDES ARAÚJO REIS

MÉTODOS ANALÍTICOS MODERNOS PARA DETERMINAÇÃO DE SILDENAFILA

E TADALAFILA EM AMOSTRAS DE MEDICAMENTOS E PLASMA HUMANO

Belo Horizonte - MG
2020
 NAIALY FERNANDES ARAÚJO REIS

MÉTODOS ANALÍTICOS MODERNOS PARA DETERMINAÇÃO DE SILDENAFILA

E TADALAFILA EM AMOSTRAS DE MEDICAMENTOS E PLASMA HUMANO

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia da

Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito

parcial à obtenção do grau de Doutora em Ciências

Farmacêuticas.

Orientador: Prof. Dr. Gerson Antônio Pianetti - UFMG

Coorientador: Prof. Dr. Christian Fernandes - UFMG

Coorientadora: Profa. Dra. Maria Beatriz Abreu Glória -

UFMG

Belo Horizonte
2020
 Dedico esse trabalho aos meus pais Marcelo e Ronise,
ao meu grande amor Pedro,
aos meus irmãos e
aos meus avós,
que sempre me apoiaram e incentivaram o meu crescimento.
 AGRADECIMENTOS

Por sempre abençoar e proteger a minha vida, me amparar nos momentos difíceis e
me dar força, coragem e sabedoria para superar os desafios agradeço imensamente
a Deus. Aos meus queridos professores orientadores sou muito grata pelos
ensinamentos, pelas valiosas contribuições técnicas que enriqueceram esse
trabalho e contribuíram para a minha formação profissional, pela confiança e
valorização dos seus alunos, pelos conselhos, apoio, pela grande amizade e pelas
oportunidades oferecidas. À toda Faculdade de Farmácia da UFMG, seus
professores e funcionários, especialmente àqueles vinculados ao LCQ-FAFAR e
CEDAFAR, o meu muito obrigada pelas experiências divididas, pela disponibilidade
e conhecimentos compartilhados. Aos eternos amigos do LCQ-FAFAR eu agradeço
pela união, prestatividade, pelas discussões e ideias enriquecedoras, pelo
aprendizado que sempre compartilhamos e pela grande amizade que construímos.
Agradeço ao Setor Técnico e Científico da Superintendência de Polícia Federal de
Minas Gerais e ao Instituto de Criminalística da Polícia Civil de Minas Gerais, pela
doação das amostras de medicamentos apreendidos. À toda equipe da FUNED,
pela parceria, por dividirem os conhecimentos e pela gentil disponibilização de
equipamentos necessários à realização desse projeto. Agradeço aos voluntários que
doaram sangue, viabilizando a realização da etapa bioanalítica deste trabalho. Às
instituições de fomento, CAPES, CNPq e FAPEMIG agradeço os auxílios financeiros
e à Farmacopeia Brasileira pelas oportunidades de empregar e ampliar meus
conhecimentos farmacêuticos. À minha amada família e amigos, sou profundamente
grata pelo amor incondicional, pelas alegrias, por sempre acreditarem em mim, por
todo suporte e incentivo à minha qualificação e ao meu crescimento pessoal. Ao
meu amigo, namorado, marido e eterno amor Pedro, muito obrigada por ser meu
parceiro de vida, por toda compreensão, paciência, por sempre me incentivar, me
encorajar diante das dificuldades e compartilhar comigo todos os momentos e
conquistas. A todos que, de alguma forma, participaram e contribuíram para a
concretização dessa etapa da minha vida, o meu MUITO OBRIGADA!
“A diferença entre o possível e o impossível está na vontade humana.”
Louis Pasteur
 RESUMO
Uma das maiores incidências de medicamentos ilegais está relacionada aos
inibidores da fosfodiesterase-5, utilizados no tratamento da disfunção erétil, incluindo
aqueles contendo citrato de sildenafila (SLD) e tadalafila (TAD). A produção e a
comercialização de medicamentos falsificados e/ou contrabandeados, além de ser
um problema criminal, representa uma séria ameaça para a saúde pública. SLD e
TAD também são utilizados na farmacoterapia da hipertensão arterial pulmonar
(HAP), uma doença rara, mas grave e progressiva. Neste contexto, torna-se
relevante o desenvolvimento de métodos analíticos modernos, simples, rápidos,
ambientalmente corretos, com elevada eficiência e aplicabilidade na determinação
de SLD e TAD em medicamentos e amostras biológicas. Portanto, no presente
trabalho, um método por UHPLC-UV para quantificação de SLD e TAD na presença
de seis produtos de degradação foi desenvolvido e validado. Os fármacos foram
submetidos a um detalhado estudo de degradação forçada. A separação dos
analitos ocorreu em menos de seis minutos e o método apresentou-se seletivo,
linear, preciso, exato e robusto. O SLD foi susceptível à degradação em meio
oxidativo, enquanto a TAD degradou em meios ácido, alcalino e oxidativo. As
estruturas químicas e os mecanismos para a formação dos principais produtos de
degradação foram propostos utilizando UHPLC-Q-TOF-MS. O método UHPLC-UV
foi aplicado na análise farmacêutica de medicamentos originais e apreendidos e foi
evidenciada falta de qualidade em algumas amostras. Ademais, um método
bioanalítico foi desenvolvido para a quantificação simultânea de TAD, SLD, N-
desmetil sildenafila e outros seis fármacos presentes no protocolo terapêutico da
HAP (anlodipino, bumetanida, digoxina, diltiazem, nifedipino e varfarina) em plasma
humano empregando-se microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) e HPLC-
MS/MS. Diferentes fatores que influenciam o procedimento da DLLME foram
investigados e otimizados, obtendo-se um método eficiente, simples, com reduzido
gasto de amostra e de solventes orgânicos. O método foi validado e os resultados
foram satisfatórios para seletividade, efeito residual, efeito matriz, linearidade,
precisão, exatidão, recuperação e estabilidade dos analitos. Amostras de plasma de
voluntários foram analisadas e o método bioanalítico se mostrou adequado para
essa aplicação.
Palavras-chave: Sildenafila. Tadalafila. Análises forenses. Método indicativo de
estabilidade. Método bioanalítico. Microextração líquido-líquido dispersiva.
 ABSTRACT
One of the highest incidences of illegal drug products is related to
phosphodiesterase-5 inhibitors, used in the treatment of erectile dysfunction,
including those containing sildenafil citrate (SLD) and tadalafil (TAD). In addition to
being a criminal justice issue, the manufacturing and commercialization of illegal
health products poses a serious threat to public health. SLD and TAD are also used
in the treatment of pulmonary arterial hypertension (PAH), a rare but serious and
progressive disease. In this context, the development of modern, simple, fast,
environmentally friendly analytical methods, with high efficiency and applicability in
the quantification of SLD and TAD in drug products and biological matrices, becomes
relevant. Therefore, in the present study, a UHPLC-UV method for SLD and TAD in
the presence of six degradation products was developed and validated. The drugs
were submitted to a detailed forced degradation study. The separation of the
analytes was possible in less than six minutes and the method was selective, linear,
precise, accurate and robust. SLD was degraded in oxidative media, whereas TAD
was degraded in acidic, alkaline and oxidative environment. The chemical structures
and the mechanisms for the formation of the main degradation products were
proposed by UHPLC-Q-TOF-MS. The UHPLC-UV method was applied in the
pharmaceutical analysis of genuine and seized medicines and the lack of quality was
evident in some of them. In addition, a bioanalytical method for the simultaneous
quantification of TAD, SLD, N-desmethylsildenafil and six other drugs presents in the
therapeutic protocol of PAH (amlodipine, bumetanide, digoxin, diltiazem, nifedipine
and warfarin) in human plasma was developed by means of dispersive liquid-liquid
microextraction (DLLME) and HPLC-MS/MS. Different factors that affected the
DLLME procedure were investigated and optimized, obtaining an efficient and simple
method, with reduced sample and solvents volumes. The method was validated and
the results were satisfactory for selectivity, residual effect, matrix effect, linearity,
precision, accuracy, recovery and stability of the analytes. Plasma samples from
volunteers were analysed and the bioanalytical method proved to be suitable for the
application.
Keywords: Sildenafil. Tadalafil. Forensic analysis. Stability-indicating assay method.
Bioanalytical method. Dispersive liquid-liquid microextraction.
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Estruturas químicas do citrato de sildenafila (A) e da tadalafila

(B).................................................................................................................................................... 25
Figura 2 – Número de notificações de medicamentos de qualidade inferior e falsificados
recebidos pela OMS no período entre 2013 e 2017, de acordo com a classe terapêutica...... 28
Figura 3 – Espectros de absorção na região do infravermelho do SLD SQR (preto) e IFA
(azul)................................................................................................................................................ 60
Figura 4 – Espectros de absorção na região do infravermelho da TAD SQR (preto) e IFA
(azul)................................................................................................................................................ 60
Figura 5 - Espectros de absorção na região do ultravioleta do SLD (A) e da TAD (B)............ 61
Figura 6 – Diagrama de distribuição das formas ao longo da faixa de pH: SLD (A) e TAD
(B).................................................................................................................................................... 64
Figura 7 – Cromatogramas obtidos a partir do método otimizado e das amostras
submetidas a testes de degradação forçada.............................................................................. 66
Figura 8 – Diagramas de Pareto referente às recuperações de SLD (A) e de TAD (B)
obtidas no planejamento fatorial 24............................................................................................. 69
Figura 9 – Cromatogramas provenientes da degradação de mistura dos IFA SLD e TAD
(vermelho) e da degradação dos IFA isolados SLD (azul) e TAD (preto) com: HCl 1 M
mantido a 50ºC durante 24 horas (A), NaOH 0,01 M mantido à temperatura ambiente
durante 24 horas (B) e H 2O2 3% (v/v) mantido à temperatura ambiente durante 24 horas
(C).................................................................................................................................................... 70
Figura 10 – Curvas analíticas para avaliação da linearidade do método para o citrato de
SLD (A) e para a TAD (B)............................................................................................................... 73
Figura 11 – Gráficos de distribuição de resíduos para o conjunto de dados do SLD (A) e
da TAD (B)....................................................................................................................................... 73
Figura 12 – Gráficos de Daniel (A) e de Lenth (B) obtidos para o teste de robustez para
SLD.................................................................................................................................................. 77
Figura 13 – Gráficos de Daniel (A) e de Lenth (B) obtidos para o teste de robustez para
TAD.................................................................................................................................................. 77
Figura 14 – Espectro no UV do SLD (A); espectro de fragmentação (MS2 full-scan) do SLD
(B); espectro no UV do PD5 (C) e espectro de fragmentação (MS2 full-scan) do PD5............ 80
Figura 15 – Espectros no UV da TAD e do PD6 sobrepostos (A); espectro de
fragmentação (MS2 full-scan) da TAD (B); espectro de varredura (MS1 full-scan) da TAD
(C) e espectro de varredura (MS1 full-scan) do PD6................................................................... 80
Figura 16 – Proposta de mecanismo de formação e estrutura do PD5..................................... 81
Figura 17 – Proposta de mecanismo de formação e estrutura do PD6 via tautomerismo
ceto-enólico em meios ácido (A) e alcalino (B)........................................................................... 83
Figura 18 – Imagens das amostras de medicamentos apreendidos disponibilizadas pela
PF e PCMG..................................................................................................................................... 85
Figura 19 – Perfil de dissolução das amostras contendo SLD.................................................. 93
Figura 20 – Perfil de dissolução das amostras contendo TAD................................................. 95
Figura 21 – Esquema ilustrativo das etapas envolvidas na DLLME......................................... 105
Figura 22 – Gráficos de log D (coeficiente de distribuição) dos analitos em função do pH.. 120
Figura 23 – Estruturas químicas dos PI utilizados para quantificação: SLD d-8 (A) e VERA
(B).................................................................................................................................................... 124
Figura 24 - Espectro obtido após fragmentação do íon precursor m/z 409, proveniente da
ionização no modo positivo do anlodipino (ANLO)................................................................... 140
Figura 25 - Espectro obtido após fragmentação do íon precursor m/z 365, proveniente da
ionização no modo positivo da bumetanida (BUM).................................................................... 140
/continua
 LISTA DE FIGURAS (continuação)

Figura 26 - Espectro obtido após fragmentação do íon precursor m/z 781, proveniente da
ionização no modo positivo da digoxina (DGX).......................................................................... 141
Figura 27 - Espectro obtido após fragmentação do íon precursor m/z 415, proveniente da
ionização no modo positivo do diltiazem (DTZ).......................................................................... 141
Figura 28 - Espectro obtido após fragmentação do íon precursor m/z 461, proveniente da
ionização no modo positivo do N-desmetil sildenafila (N-DMS)............................................... 142
Figura 29 - Espectro obtido após fragmentação do íon precursor m/z 347, proveniente da
ionização no modo positivo do nifedipino (NIF)...................................................................... 142
Figura 30 - Espectro obtido após fragmentação do íon precursor m/z 475, proveniente da
ionização no modo positivo do sildenafila (SLD)....................................................................... 143
Figura 31 - Espectro obtido após fragmentação do íon precursor m/z 390, proveniente da
ionização no modo positivo da tadalafila (TAD)......................................................................... 143
Figura 32 - Espectro obtido após fragmentação do íon precursor m/z 309, proveniente da
ionização no modo positivo da varfarina (VAR)......................................................................... 144
Figura 33 - Espectro obtido após fragmentação do íon precursor m/z 483, proveniente da
ionização no modo positivo do sildenafila-d8 (SLD d-8)........................................................... 144
Figura 34 - Espectro obtido após fragmentação do íon precursor m/z 455, proveniente da
ionização no modo positivo do verapamil (VERA)..................................................................... 145
Figura 35 – Cromatograma obtido a partir das condições cromatográficas otimizadas
para a determinação simultânea de ANLO, BUM, DGX, DTZ, N-DMS, NIF, SLD, TAD, VAR
utilizando SLD d-8 e VERA como PI............................................................................................. 149
Figura 36 – Superfícies de resposta obtidas para recuperação de ANLO (A), BUM (B), TAD
(C) e DTZ (D) durante a otimização da etapa de PPT usando planejamento CCD................... 151
Figura 37 – Avaliação do pH do tampão a ser utilizado na DLLME.......................................... 153
Figura 38 – Diagrama de distribuição das formas ao longo da faixa de pH para a BUM........ 154
Figura 39 – Avaliação da concentração do tampão a ser utilizada na DLLME........................ 156
Figura 40 – Avaliação da força iônica do tampão a ser utilizado na DLLME........................... 158
Figura 41 – Avaliação do tipo do solvente extrator a ser utilizado na DLLME........................ 160
Figura 42 – Avaliação do volume do solvente extrator a ser utilizado na DLLME.................. 162
Figura 43 – Avaliação do volume do tampão a ser utilizado na DLLME................................... 164
Figura 44 – Avaliação do solvente dispersante a ser utilizado na DLLME............................... 166
Figura 45 – Avaliação do volume do solvente dispersante a ser utilizado na DLLME............ 168
Figura 46 – Avaliação do tempo de agitação em vórtex a ser utilizado na DLLME................. 170
Figura 47 – Etapas do método DLLME otimizado....................................................................... 172
Figura 48 – Cromatogramas obtidos para uma amostra de LIQ (A) e uma amostra plasma
branco normal (plasma normal 1) (B) para avaliação da seletividade do método
bioanalítico..................................................................................................................................... 174
Figura 49 – Microtubo após etapa de evaporação do solvente extrator proveniente da
DLLME (A) e PPT (B) e vial contendo amostra ressuspendida após procedimento da
DLLME (A) e PPT (B)..................................................................................................................... 177
Figura 50 – Curvas de calibração obtidas durante a avaliação da linearidade no terceiro
dia de análise.................................................................................................................................. 180
Figura 51 – Cromatogramas obtidos na análise da amostra de plasma dos pacientes 2 (A)
e 7 (B).............................................................................................................................................. 184
 LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Métodos farmacopeicos, por HPLC-UV, para determinação do teor de SLD e
TAD em IFA e comprimidos.......................................................................................................... 31
Tabela 2 – Métodos indicativos de estabilidade para SLD e TAD encontrados na literatura. 35
Tabela 3 – Funções farmacotécnicas e proporções estimada dos excipientes utilizados
na fabricação dos comprimidos Viagra® e Cialis®...................................................................... 38
Tabela 4 – Concentrações das Soluções padrão para preparo da curva analítica................. 44
Tabela 5 – Condições cromatográficas e variações das mesmas testadas durante o
desenvolvimento do método analítico......................................................................................... 45
Tabela 6 – Resumo das condições cromatográficas definitivas do método analítico
seletivo para SLD, TAD e seus produtos de degradação utilizando UHPLC-UV..................... 45
Tabela 7 – Gradiente definitivo do método analítico seletivo para SLD, TAD e seus
produtos de degradação utilizando UHPLC-UV.......................................................................... 46
Tabela 8 – Variáveis independentes avaliadas no planejamento fatorial 24 e os níveis
avaliados para cada uma delas.................................................................................................... 46
Tabela 9 – Preparo das soluções contendo SLD e TAD SQR para avaliação da linearidade. 50
Tabela 10 – Parâmetros e variações avaliados no teste de robustez....................................... 52
Tabela 11 – Número de comprimidos utilizados nos testes de controle de qualidade........... 56
Tabela 12 – Números de onda e atribuições das bandas de absorção obtidas nos
espectros de infravermelho do SLD IFA e SQR.......................................................................... 59
Tabela 13 – Números de onda e atribuições das bandas de absorção obtidas nos
espectros de infravermelho da TAD IFA e SQR.......................................................................... 60
Tabela 14 – Parâmetros de adequabilidade do sistema obtidos com a solução padrão e
amostras degradadas durante 24 horas e utilizando-se o método desenvolvido e
otimizado apresentado nas Tabelas 6 e 7 (páginas 45 e 46)..................................................... 66
Tabela 15 – Matriz experimental e respostas obtidas com o planejamento fatorial 24........... 67
Tabela 16 – Efeitos principais, valores inferiores e superiores do intervalo de confiança
de cada efeito e interpretação da significância de cada efeito para na recuperação de SLD
e TAD............................................................................................................................................... 68
Tabela 17 – Resultados obtidos no teste de seletividade com as soluções contendo
apenas os fármacos e soluções contendo fármacos + placebo............................................... 71
Tabela 18 – Avaliação das premissas necessárias à utilização do MMQO para o conjunto
de dados do SLD e da TAD........................................................................................................... 72
Tabela 19 - Porcentagens de recuperação de SLD e TAD e DPR obtidos para a avaliação
da exatidão e precisão do método analítico................................................................................ 75
Tabela 20 – Avaliação do efeito das variáveis na determinação de SLD e TAD por UHPLC.. 76
Tabela 21 – Áreas sob os picos do SLD e da TAD e comparação estatística quando são
utilizados diferentes diluentes...................................................................................................... 78
Tabela 22 – Descrição e características físicas dos medicamentos apreendidos e
originais.......................................................................................................................................... 87
Tabela 23 – Resultados obtidos no teste de identificação e doseamento das amostras
apreendidas e autênticas contendo SLD e TAD......................................................................... 89
Tabela 24 – Resultados obtidos no teste de uniformidade de conteúdo das amostras
apreendidas e autênticas contendo SLD e TAD......................................................................... 91
Tabela 25 - Resultados obtidos no teste de dissolução para os comprimidos contendo
SLD.................................................................................................................................................. 92
Tabela 26 - Resultados obtidos no teste de dissolução para os comprimidos contendo
TAD.................................................................................................................................................. 94

/continua
 LISTA DE TABELAS (continuação)
Tabela 27 – Métodos bioanalíticos para a determinação de SLD e TAD em plasma
humano........................................................................................................................................... 109
Tabela 28 – Características físico-químicas dos analitos selecionados para
desenvolvimento do método bioanalítico.................................................................................. 117
Tabela 29 – Características farmacocinéticas dos analitos selecionados para
desenvolvimento do método bioanalítico................................................................................... 119
Tabela 30 – Valores testados para os respectivos parâmetros durante a otimização da
fonte de ionização.......................................................................................................................... 126
Tabela 31 – Gradiente utilizado durante etapa inicial de desenvolvimento do método.......... 126
Tabela 32 – Resumo das condições cromatográficas definitivas do método bioanalítico
por HPLC-MS/MS............................................................................................................................ 127
Tabela 33 – Gradiente definitivo do método bioanalítico por HPLC-MS/MS............................ 127
Tabela 34 – Variáveis e seus níveis empregadas para a otimização da etapa de PPT........... 129
Tabela 35 – Concentrações dos analitos nas amostras de plasma enriquecidas para
avaliação da linearidade, precisão e exatidão do método......................................................... 134
Tabela 36 – Transições de massas monitoradas e valores de Dwell Time, DP, CE e CXP
otimizados...................................................................................................................................... 139
Tabela 37 – Parâmetros de ionização da fonte otimizados por FIA.......................................... 145
Tabela 38 – Tempos de retenção médios obtidos para os 11 analitos utilizando-se as
condições cromatográficas otimizadas....................................................................................... 148
Tabela 39 – Propriedades físico-químicas dos solventes extratores avaliados durante
otimização da DLLME.................................................................................................................... 159
Tabela 40 – Resultados de DPR da área sob o pico normalizada com a utilização de
diferentes substâncias como PI................................................................................................... 171
Tabela 41 – Porcentagem da área de picos interferentes em relação à área do analito de
interesse no LIQ............................................................................................................................. 175
Tabela 42 – Porcentagem da área de picos interferentes na amostra de plasma branco
após injeção da amostra de LSQ em relação à área do analito de interesse no LIQ para
determinação do efeito residual................................................................................................... 176
Tabela 43 - Avaliação do efeito matriz utilizando o FMN para as amostras provenientes do
preparo de amostra por DLLME e por PPT.................................................................................. 176
Tabela 44 - Equações da reta e coeficientes de determinação obtidos para os analitos
durante avaliação da linearidade da faixa de trabalho............................................................... 179
Tabela 45 – Valores de DPR e EPR obtidos durante a avaliação da precisão e exatidão
intracorrida e intercorridas e recuperação do método bioanalítico......................................... 181
Tabela 46 – Resultados de exatidão (EPR) e precisão (DPR) obtidos para as amostras
provenientes dos estudos de estabilidade................................................................................. 182
Tabela 47 – Concentrações plasmáticas obtidas em plasma de pacientes voluntários
atendidos no Serviço de Anticoagulação, Hematologia e Oncologia do Hospital das
Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais.................................................................... 184
 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ANLO Anlodipino
ANOVA Análise de variância
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
BPF Boas Práticas de Fabricação de Medicamentos
BUM Bumetanida
C8 Sílica quimicamente ligada a grupos octilsilanos
C18 Sílica quimicamente ligada a grupos octadecilsilanos
Cmáx Concentração plasmática máxima
COEP Comitê de Ética em Pesquisa
CQA Controle de qualidade de alta concentração
CQB Controle de qualidade de alta concentração
CQD Controle de qualidade de diluição
CQM Controle de qualidade de média concentração
CuSO4 Sulfato de cobre
CV Coeficiente de variação
DGX Digoxina
DLLME Microextração líquido-líquido dispersiva, em inglês Dispersive
liquid-liquid microextraction.
DTZ Diltiazem
DPF Departamento de Polícia Federal
DPR Desvio padrão relativo
ECC Estabilidade após ciclos de congelamento e descongelamento
ECD Estabilidade de curta duração
ELD Estabilidade de longa duração
EPP Estabilidade pós-processamento
EPR Erro padrão relativo
ESI Ionização por electrospray, em inglês electrospray ionization
EUA Estados Unidos da América
FDA Food and Drug Administration
g Força centrífuga
HAP Hipertensão arterial pulmonar
HCl Ácido clorídrico
H2O2 Peróxido de hidrogênio
HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência, em inglês High
performance liquid chromatography
HPLC-MS/MS Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à
espectrometria de massas sequencial, em inglês High
performance liquid chromatography coupled with tandem mass
spectrometry

/continua
 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS (continuação)

ICH International Conference on Harmonisation of Technical

Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use
IFA Insumo farmacêutico ativo
INMETRO Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia
k Fator de retenção
KD Coeficiente de distribuição
LIQ Limite inferior de quantificação
LSQ Limite superior de quantificação
Log P Coeficiente de partição
Lux Unidade da intensidade de iluminação
MMQO Método dos mínimos quadrados ordinários
m/z Razão massa-carga
N Número de pratos teóricos
NaOH Hidróxido de sódio
N-DMS N-desmetil sildenafila
NIF Nifedipino
OMS / WHO Organização Mundial da Saúde, em inglês World Health
Organization
PCMG Polícia Civil de Minas Gerais
PD Produto de degradação
PDE-5 Fosfodiesterase-5
PF Polícia Federal
PI Padrão interno
pKa Constante de dissociação
PPT Precipitação de proteínas, em inglês Protein precipitation
PVDF Fluoreto polivinidileno
R2 Coeficiente de determinação
R Coeficiente de correlação
rpm Rotações por minuto
SLD Sildenafila
SLD d-8 Sildenafila d-8 (isótopo deuterado do SLD)
SPE Extração em fase sólida, em inglês Solid phase extraction
TAD Tadalafila
TEA Trietilamina
TF Fator de cauda, em inglês Tailing factor
tR Tempo de retenção
UHPLC Cromatografia líquida de ultra eficiência, em inglês Ultra high
performance liquid chromatography

/continua
 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS (continuação)

UHPLC-Q-TOF-MS Cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à

espectrometria de massas sequencial, com analisador do tipo
quadrupolo-tempo-de-voo, em inglês Ultra high performance
liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight mass
spectrometry
UV Ultravioleta
V Volt
VERA Verapamil
Watt Unidade de potência
 SUMÁRIO

CONSIDERAÇÕES INICIAIS................................................................................. 19
CAPÍTULO I: AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE MEDICAMENTOS
AUTÊNTICOS E APREENDIDOS CONTENDO CITRATO DE SILDENAFILA E
TADALAFILA POR UHPLC-UV............................................................................ 21
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................... 21
2 OBJETIVOS........................................................................................................ 23
2.1 Objetivo geral.................................................................................................. 23
2.2 Objetivos específicos..................................................................................... 23
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................................... 24
3.1 Sildenafila e tadalafila: inibidores da fosfodiesterase-5............................. 24
3.2 Fabricação e comercialização ilegal de medicamentos............................. 26
3.3 Aplicação de técnicas analíticas em atividades forenses.......................... 29
3.3.1 Métodos cromatográficos com detecção no ultravioleta para
determinação de SLD e TAD............................................................................... 30
3.4 Controle de qualidade dos medicamentos.................................................. 36
4 MATERIAIS......................................................................................................... 38
4.1 Substâncias químicas de referência (SQR), IFA e placebo........................ 38
4.2 Comprimidos originais e apreendidos......................................................... 39
4.3 Reagentes....................................................................................................... 39
4.4 Materiais, vidrarias e instrumentos.............................................................. 39
4.5 Equipamentos................................................................................................. 40
5 MÉTODOS.......................................................................................................... 41
5.1 Determinação da solubilidade dos IFA SLD e TAD..................................... 41
5.2 Identificação por espectrofotometria no infravermelho............................. 41
5.3 Determinação dos máximos de absorção na região do ultravioleta do
SLD e da TAD........................................................................................................ 41
5.4 Estudos de degradação forçada................................................................... 42
5.4.1 Soluções de degradação............................................................................ 43
5.4.2 Soluções padrão de SLD e TAD................................................................. 44
5.5 Desenvolvimento do método para quantificação simultânea de SLD,
TAD e potenciais produtos de degradação por UHPLC-UV............................. 44
5.6 Otimização da etapa do preparo de amostra para os testes de
determinação de teor de SLD e TAD em comprimidos..................................... 46
5.7 Validação do método analítico...................................................................... 47
5.7.1 Adequabilidade do sistema........................................................................ 48
5.7.2 Seletividade.................................................................................................. 48
5.7.3 Linearidade.................................................................................................. 49
5.7.4 Precisão e exatidão..................................................................................... 51
5.7.5 Robustez...................................................................................................... 51
5.7.6 Limites de detecção e quantificação......................................................... 52
/continua
 SUMÁRIO (continuação)

5.7.7 Testes de seletividade e recuperação para diferentes diluentes........... 53

5.8 Elucidação das estruturas químicas dos produtos de degradação.......... 53
5.9 Análise dos medicamentos originais e apreendidos.................................. 54
5.9.1 Recebimento e armazenamento das amostras........................................ 54
5.9.2 Caracterização física dos comprimidos originais e apreendidos.......... 55
5.9.3 Aplicação do método: avaliação da qualidade dos medicamentos
originais e apreendidos....................................................................................... 55
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................... 59
6.1 Solubilidade dos IFA SLD e TAD.................................................................. 59
6.2 Identificação por espectrofotometria no infravermelho............................. 59
6.3 Determinação dos máximos de absorção na região do ultravioleta......... 61
6.4 Estudos de degradação forçada................................................................... 61
6.5 Desenvolvimento do método para quantificação simultânea de SLD,
TAD e potenciais produtos de degradação por UHPLC-UV............................. 63
6.6 Resultados da otimização do preparo da amostra para os testes de
determinação de teor de SLD e TAD em comprimidos..................................... 67
6.7 Validação do método analítico...................................................................... 70
6.7.1 Adequabilidade do sistema........................................................................ 70
6.7.2 Seletividade.................................................................................................. 70
6.7.3 Linearidade.................................................................................................. 72
6.7.4 Precisão e exatidão..................................................................................... 75
6.7.5 Robustez...................................................................................................... 75
6.7.6 Limites de detecção e de quantificação.................................................... 77
6.7.7 Testes de seletividade e recuperação para diferentes diluentes........... 78
6.8 Propostas de elucidação estrutural dos principais produtos de
degradação........................................................................................................... 79
6.9 Análise dos medicamentos originais e apreendidos.................................. 84
6.9.1 Caracterização física dos comprimidos originais e apreendidos.......... 84
6.9.2 Aplicação do método: avaliação da qualidade dos medicamentos
originais e apreendidos....................................................................................... 89
7 CONCLUSÕES................................................................................................... 97
CAPÍTULO II: QUANTIFICAÇÃO DE SILDENAFILA, N-DESMETIL
SILDENAFILA, TADALAFILA E OUTROS SEIS FÁRMACOS UTILIZADOS
NO TRATAMENTO DA HIPERTENSÃO ARTERIAL PULMONAR EM
PLASMA HUMANO............................................................................................... 98
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................... 98
2 OBJETIVOS........................................................................................................ 100
2.1 Objetivo geral.................................................................................................. 100
2.2 Objetivos específicos..................................................................................... 100
/continua
 SUMÁRIO (continuação)

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................................... 101

3.1 Métodos bioanalíticos.................................................................................... 101
3.1.1 Preparo de amostra..................................................................................... 102
3.1.2 Métodos bioanalíticos para quantificação de SLD e TAD em plasma
humano.................................................................................................................. 107
3.2 Hipertensão arterial pulmonar (HAP)........................................................... 112
3.2.2 Farmacoterapia da HAP.............................................................................. 113
3.3 Características físico-químicas e farmacocinéticas dos fármacos
utilizado no tratamento da HAP abordados no presente estudo..................... 116
4 MATERIAIS......................................................................................................... 121
4.1 SQR e IFA........................................................................................................ 121
4.2 Amostras de plasma humano....................................................................... 121
4.3 Reagentes....................................................................................................... 122
4.4 Materiais, vidrarias e instrumentos.............................................................. 122
4.5 Equipamentos................................................................................................. 123
5 MÉTODOS.......................................................................................................... 124
5.1 Desenvolvimento do método bioanalítico................................................... 124
5.1.1 Determinação dos parâmetros espectrométricos.................................... 124
5.1.2 Otimização das condições cromatográficas............................................ 126
5.1.3 Otimização da etapa de preparo de amostra............................................ 128
5.2 Validação do método bioanalítico................................................................ 131
5.2.1 Seletividade.................................................................................................. 131
5.2.2 Efeito residual.............................................................................................. 132
5.2.3 Efeito matriz................................................................................................. 132
5.2.4 Linearidade.................................................................................................. 134
5.2.5 Precisão e exatidão..................................................................................... 135
5.2.6 Recuperação................................................................................................ 136
5.2.7 Estabilidade dos analitos em plasma humano......................................... 136
5.3 Análise de amostras reais............................................................................. 137
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................... 138
6.1 Desenvolvimento do método bioanalítico................................................... 138
6.1.1 Determinação dos parâmetros espectrométricos.................................... 138
6.1.2 Otimização das condições cromatográficas............................................ 145
6.1.3 Otimização da etapa de preparo de amostra............................................ 150
6.1.4 Definição dos padrões internos (PI) e método DLLME otimizado.......... 171
6.2 Validação do método bioanalítico................................................................ 173
6.2.1 Seletividade.................................................................................................. 173
6.2.2 Efeito residual.............................................................................................. 175
6.2.3 Efeito matriz................................................................................................. 176
6.2.4 Linearidade.................................................................................................. 178
/continua
 SUMÁRIO (continuação)

6.2.5 Precisão, exatidão e recuperação.............................................................. 181

6.2.6 Estabilidade dos analitos em plasma........................................................ 182
6.3 Análise de amostras reais............................................................................. 183
7 CONCLUSÕES................................................................................................... 185
CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................................................... 186
REFERÊNCIAS...................................................................................................... 187
APÊNDICE A – Artigo publicado no Journal of Chromatographic Science-
https://doi.org/10.1093/chromsci/bmaa073........................................................ 203
APÊNDICE B – Artigo publicado na revista Química Nova -
https://doi.org/10.21577/0100-4042.20170565 (trabalho em colaboração)...... 204
APÊNDICE C – Artigo publicado no Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis - https://doi.org/10.1016/j.jpba.2020.113403 (trabalho
em colaboração)................................................................................................... 205
APÊNDICE D – Artigo publicado no Current Pharmaceutical Analysis -
DOI: 10.2174/1573412914666180730123426 (trabalho em colaboração)......... 206

ANEXO A – Certificados de apresentação e de Relevância Acadêmica na

XXVII Semana de Iniciação Científica / PRPQ (Semana do Conhecimento
UFMG 2018)........................................................................................................... 207
ANEXO B – Certificado 1 de apresentação na sessão de pôsteres do III
Simpósio Nacional em Ciências Farmacêuticas (SINCIFAR – 2018)............... 208
ANEXO C – Certificado 2 de apresentação na sessão de pôsteres do III
Simpósio Nacional em Ciências Farmacêuticas (SINCIFAR – 2018)............... 208
ANEXO D – Certificado de apresentação na sessão de pôsteres do IV
Congresso of the Brazilian Association of Pharmaceutical Sciences (ABCF
Congress - 2018)................................................................................................... 209
ANEXO E – Certificado de apresentação na XXIX Semana de Iniciação
Científica / PRPQ (Semana do Conhecimento UFMG 2020)............................. 209
 19

CONSIDERAÇÕES INICIAIS

Sildenafila (SLD) e tadalafila (TAD) são fármacos inibidores da fosfodiesterase-5

(PDE-5), largamente empregados na farmacoterapia da disfunção erétil e também
fazem parte do protocolo de tratamento da hipertensão arterial pulmonar (HAP).

De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) e levantamentos realizados

por autoridades sanitárias e policiais brasileiras, medicamentos contendo SLD e
TAD encontram-se entre os mais falsificados e contrabandeados. Tendo em vista as
graves consequências e perigos relacionados com a falsificação de medicamentos,
além do crescimento constante das solicitações de análises forenses, é relevante o
desenvolvimento de métodos analíticos atuais, com utilização de tecnologias
modernas, as quais visam reduzir o tempo, consumo de solventes e melhorar a
eficiência de análise. Nesse contexto, a cromatografia líquida de ultra eficiência
(UHPLC, em inglês Ultra high performance liquid chromatography) mostra-se
vantajosa, uma vez que proporciona análises rápidas, elevada eficiência
cromatográfica, além da possibilidade de minimizar o impacto ambiental e
ocupacional decorrente do gasto de menores volumes de reagentes.

No desenvolvimento de métodos bioanalíticos, esses parâmetros também estão

sendo cada vez mais valorizados. Técnicas de preparo de amostra baseadas em
microextração, com a utilização de pequenos volumes de amostra e solventes, vêm
sendo desenvolvidas como alternativas aos métodos clássicos de extração. Como
técnica de separação e detecção, a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada
à espectrometria de massas sequencial (HPLC-MS/MS, em inglês High performance
liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry) é a técnica de
escolha para a determinação de fármacos e metabólitos em matrizes biológicas,
uma vez que garante detectabilidade e seletividade adequadas.

Portanto, o presente estudo tem como objetivo principal desenvolver e validar

métodos analíticos modernos, simples, rápidos, ambientalmente corretos, com
elevada eficiência e aplicabilidade na determinação de SLD e TAD em
medicamentos e em plasma humano.
 20

O trabalho foi dividido em dois capítulos. O Capítulo I trata da avaliação da

qualidade de medicamentos autênticos e apreendidos pelas autoridades policiais
brasileiras, contendo SLD e TAD, empregando a técnica UHPLC-UV e coluna com
partículas superficialmente porosas. Os resultados deste capítulo foram publicados
em artigo científico no Journal of Chromatographic Science (APÊNDICE A). No
Capítulo II é abordada a quantificação simultânea de SLD, N-desmetil sildenafila (N-
DMS), TAD e outros seis fármacos utilizados no tratamento da hipertensão arterial
pulmonar (HAP) em plasma humano por meio da microextração líquido-líquido
dispersiva (DLLME, em inglês Dispersive liquid-liquid microextraction) e HPLC-
MS/MS.
 21

CAPÍTULO I: AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE MEDICAMENTOS AUTÊNTICOS

E APREENDIDOS CONTENDO CITRATO DE SILDENAFILA E TADALAFILA POR
UHPLC-UV

1 INTRODUÇÃO

De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), medicamentos de estilo de

vida, incluindo aqueles para disfunção erétil, constituem a quarta maior classe de
produtos de baixa qualidade ou falsificados no mundo. Levantamentos realizados
por autoridades sanitárias e policiais brasileiras revelam que medicamentos
contendo os inibidores da PDE-5, incluindo SLD e TAD, são os mais falsificados no
país, seguidos por esteroides anabolizantes (AMES; SOUZA, 2012; HURTADO;
LASMAR, 2014; WHO, 2017).

Estudos têm sido realizados para a determinação de compostos orgânicos e

inorgânicos em medicamentos ilegais contendo SLD e TAD. Esses estudos
indicaram que alguns desses produtos não têm a substância ativa, possuem
quantidade incorreta do fármaco, alegam conter SLD, mas, em vez disso, eles têm
TAD ou uma mistura desses insumos farmacêuticos ativos (IFA) na sua composição
e/ou apresentaram grandes quantidades de contaminantes (COELHO; LISBOA,
2017; ORTIZ et al., 2011; ORTIZ et al., 2012a; ORTIZ et al., 2012b; ORTIZ et al.,
2013; VEJI et al., 2008).

Nesse contexto, um aspecto importante que deve ser considerado durante o

desenvolvimento de um método analítico, principalmente aqueles que serão
utilizados na análise de medicamentos falsificados/contrabandeados, é a sua
seletividade em relação aos analitos e aos seus produtos de degradação, uma vez
que, como não são conhecidos os procedimentos de fabricação, embalagem e
armazenamento desses produtos, os mesmos podem conter impurezas
desconhecidas.

Uma das técnicas mais utilizadas para a identificação e a quantificação de analitos

em formulações farmacêuticas é a cromatografia líquida com detecção na região do
ultravioleta, sendo que, a cromatografia líquida de ultra eficiência (UHPLC)
 22

apresenta-se como uma vantajosa alternativa, uma vez que permite análises mais
rápidas, mais eficientes e com menor consumo de solventes (NOGUEIRA et al.,
2011; WREN; TCHELITCHEFF, 2006).

Os medicamentos falsificados e/ou contrabandeados representam alto risco

sanitário, uma vez que os mesmos são produzidos sem seguir os rigorosos padrões
de qualidade e segurança necessários. Além disso, não são submetidos aos testes
de qualidade e eficácia exigidos pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA), não havendo certeza sobre a dose ou o princípio ativo administrado
(DÉGARDIN; ROGGO; MARGOT, 2014).

Alguns estudos disponíveis na literatura investigaram, individualmente, a

estabilidade do SLD (ABD-ELBARY et al., 2004; DARAGHMEH et al., 2001; LIEW;
PEH, 2018; SEGALL et al., 2000; TAMBE; DEODHAR; PRAKYA, 2016) e da TAD
(PATEL; PATEL, 2014; RAO et al., 2008; SATHEESH et al., 2013, SEN; PANTEL,
2015). Existem também alguns métodos por cromatografia líquida de alta eficiência
com detecção na região do ultravioleta (HPLC-UV) (FIDAN, BAKIRDERE, 2016;
ORSI et al., 2009; YANG et al. 2010) e cromatografia líquida de ultra eficiência
(UHPLC-UV) (ORTIZ; ANTUNES; LINDEN, 2010) que permitem a quantificação
simultânea de SLD e TAD em preparações farmacêuticas, mas que não contemplam
seus produtos de degradação.

Entretanto, um método rápido e efetivo para a quantificação simultânea de SLD e

TAD na presença de seus prováveis produtos de degradação usando UHPLC-UV
ainda não foi descrito. Também não foi encontrado um estudo no qual foi realizada
uma verificação detalhada das características farmacêuticas de medicamentos
ilegais contendo SLD e TAD.

Diante disso, neste Capítulo será contemplado o desenvolvimento e validação de um

método para a quantificação simultânea de SLD e TAD por UHPLC-UV, que também
é seletivo aos potenciais produtos de degradação desses fármacos. A aplicação do
método será apresentada na avaliação completa e detalhada da qualidade de
comprimidos originais e apreendidos pelas autoridades policiais brasileiras.
 23

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Desenvolver e validar método analítico seletivo para SLD, TAD e seus produtos de
degradação por UHPLC-UV, a ser utilizado com o propósito de identificar,
caracterizar e verificar a qualidade de medicamentos originais, falsificados e/ou
contrabandeados.

2.2 Objetivos específicos

• Submeter os IFA SLD e TAD a estudo de degradação forçada.

• Desenvolver e validar método para quantificação simultânea de SLD e TAD
que seja também seletivo aos potenciais produtos de degradação desses
fármacos utilizando UHPLC-UV.
• Propor estruturas químicas e mecanismos de formação para os principais
produtos de degradação empregando cromatografia líquida de ultra eficiência
acoplada à espectrometria de massas sequencial, com analisador do tipo
quadrupolo-tempo-de-voo (UHPLC-Q-TOF-MS, em inglês Ultra high
performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight
mass spectrometry).
• Aplicar o método UHPLC-UV no controle de qualidade de medicamentos,
submetendo amostras de comprimidos originais e apreendidas aos testes de
identificação, doseamento, uniformidade de doses unitárias, dissolução e
perfil de dissolução.
 24

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Sildenafila e tadalafila: inibidores da fosfodiesterase-5

Os inibidores da fosfodiesterase são amplamente utilizados para o tratamento da

disfunção erétil, a qual é definida como a incapacidade persistente de obter e/ou
manter uma ereção suficiente para uma função sexual satisfatória. Por serem
inibidores seletivos da PDE-5, exercem seu efeito farmacológico por meio de um
aumento na concentração intracelular de monofosfato cíclico de guanosina (GMPc),
um potente vasodilatador e inibidor de proliferação celular. O óxido nítrico produzido
pelas células endoteliais ativa a enzima guanilato ciclase, aumentando a produção
de GMPc. Entretanto, sua ação é breve, pois é rapidamente degradado pela enzima
PDE-5. Os inibidores da fosfodiesterase prolongam o efeito vasodilatador do óxido
nítrico por inibir a ação desta enzima (GRESSER; GLEITER, 2002).

Com comercialização liberada em 1998 para o tratamento da disfunção erétil, o

citrato de sildenafila (citrato de SLD) foi o primeiro fármaco da classe dos inibidores
da PDE-5. Além de ser utilizado para o tratamento da disfunção erétil, o SLD foi
aprovado em 2005 pela agência regulatória americana, Food and Drug
Administration (FDA), para utilização no tratamento da hipertensão arterial pulmonar
(HAP) (GALIE et al., 2005; SIMIELE et al., 2015), uma vez que a PDE-5 é também
abundantemente expressa no tecido pulmonar (AHN et al., 1991). O medicamento
referência contendo SLD aprovado para tratamento da HAP no Brasil é o Revatio®, o
qual consiste em comprimidos revestidos contendo 20 mg de SLD (ANVISA, 2020a).

Desde a introdução do SLD, foram desenvolvidos outros inibidores da PDE-5 para

uso no tratamento da disfunção erétil e da HAP, como a tadalafila (TAD) e a
vardenafila (MICHEL; HOFFMAN, 2012).

Os medicamentos referência utilizados no tratamento da disfunção erétil Viagra®

(contendo SLD, na forma de citrato) e Cialis® (contendo TAD, na forma de base),
além dos medicamentos genéricos e similares contendo também estes IFA são
comercializados na forma de comprimidos revestidos para administração oral. Tais
medicamentos apresentam mecanismos de ação semelhantes, diferindo-se
 25

principalmente quanto à potência de inibição da enzima e às propriedades

farmacocinéticas, como velocidade de absorção, meia-vida plasmática e duração do
efeito (CARSON; NOH, 2002).

O citrato de SLD (Figura 1A) possui fórmula molecular C22H30N6O4S.C6H8O7 e

massa molar igual a 666,70 g/mol. A base livre (C22H30N6O4S) apresenta massa
molar de 474,58 g/mol. É pouco solúvel em água e em metanol e praticamente
insolúvel em hexano (THE UNITED, 2019). Apresenta pKa igual a 5,99 (PUBCHEM,
2020) e coeficiente de partição octanol-água (log P) fortemente influenciado pelo pH
do meio, de modo que o log P pode apresentar valores diferentes como 1,59, -0,52 e
1,13 para as espécies neutra, catiônica e aniônica, respectivamente. Estes valores
foram obtidos experimentalmente, por Wang, Chow e Zuo (2008).

Figura 1 – Estruturas químicas do citrato de sildenafila (A) e da tadalafila (B).

Fonte: adaptado de THE UNITED, 2019.

A TAD (Figura 1B), por sua vez, possui fórmula molecular C22H19N3O4 e massa
molar 389,40 g/mol. É praticamente insolúvel em água, facilmente solúvel em
dimetilsulfóxido e pouco solúvel em cloreto de metileno (THE UNITED, 2019). Trata-
se de uma molécula neutra na faixa de pH entre 0 e 14 e possui log P de 1,64
(CHEMAXON, 2018; PUBCHEM, 2020).

Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) e as autoridades sanitárias e

policiais do Brasil, um dos principais alvos de contrafação são os medicamentos que
contêm inibidores da PDE-5, dentre eles, aqueles contendo SLD e TAD. Os
medicamentos ilegais são agrupados em duas categorias, sendo elas: falsificados e
contrabandeados (origem estrangeira, internalizados de modo irregular no Brasil)
(AMES; SOUZA, 2012; HURTADO; LASMAR, 2014; WHO, 2017).
 26

3.2 Fabricação e comercialização ilegal de medicamentos

Um medicamento falsificado é um produto embalado e etiquetado indevidamente, de

maneira deliberada e fraudulenta, no que diz respeito à identidade e/ou à origem. A
falsificação aplica-se tanto a medicamentos referência quanto a genéricos e
similares, e pode incluir medicamentos sem IFA, com uma quantidade insuficiente
ou excessiva do IFA, com o IFA inadequado ou com embalagem falsa (WHO, 1999).

Já os medicamentos não registados/não licenciados são definidos como aqueles

que não foram submetidos a avaliação e/ou aprovação das autoridades nacionais ou
regionais reguladoras dos medicamentos para o mercado em que são
vendidos/distribuídos ou utilizados (WHO, 2017). De acordo com a lei nº 6360/1976,
apenas é permitida a venda de medicamentos em território nacional, inclusive
importado, após registro em órgão público competente (BRASIL, 1976). Dessa
forma, ao adentrar ilegalmente no país, os medicamentos sejam eles falsificados ou
não registrados, assumem a natureza de contrabando (ANVISA, 2006).

A falsificação de medicamentos e sua comercialização é uma atividade ilegal

altamente lucrativa, considerando o baixo custo de produção destes produtos, uma
vez que não seguem os padrões de qualidade e segurança necessários. Além disso,
apresenta risco menor de repressão pelas autoridades policiais em comparação ao
tráfico de drogas, estando ligadas diretamente a organizações criminosas
internacionais (DUBOSE, 2006; HURTADO; LASMAR; 2014).

Conforme descrito na Lei nº 9677/1998, falsificar, corromper, adulterar, alterar,

distribuir ou vender produtos destinados a fins terapêuticos ou medicinais é
considerado crime hediondo contra a saúde pública, inafiançável, com pena de
reclusão de 10 a 15 anos e multa (BRASIL, 1998). Além de ser uma questão
criminal, a produção e comercialização de medicamentos falsificados e/ou
contrabandeados representa uma séria ameaça para a saúde pública (DÉGARDIN;
ROGGO; MARGOT, 2014), uma vez que o uso de um medicamento falsificado pode
simplesmente não causar nenhuma reação no paciente, pode provocar um
agravamento do estado de saúde pela ausência do IFA ou pelo seu teor inadequado
e/ou pode causar problemas pela presença de impurezas (provenientes da
 27

degradação do IFA e excipientes) e substâncias desconhecidas adicionadas pelo

fabricante clandestino.

Como o comércio de medicamentos falsificados é ilegal, não é possível saber ao

certo a proporção da sua ocorrência. Entretanto, o número de relatos de apreensão
de medicamentos falsificados está aumentando e as estimativas da sua dimensão
são alarmantes, tratando-se de um problema mundial (DÉGARDIN; ROGGO;
MARGOT, 2014). A OMS estima que cerca de 10% dos medicamentos no mundo
são falsificados e que esse mercado de vendas pode ter faturado cerca de 75
bilhões de dólares em 2010 (WHO, 2016).

O aumento significativo da falsificação e comercialização de medicamentos ilegais

pode ser associado a um acesso mais fácil pelos falsificadores às tecnologias
necessárias para replicar produtos farmacêuticos originais e pela falta de controle
efetivo sobre os medicamentos que são vendidos por fornecedores ilícitos nas
plataformas virtuais (KRAKOWSKA et al., 2016). Têm sido descobertos, em todos os
continentes, locais de fabricação ligados à produção clandestina de medicamentos,
havendo centros que realizam produção em escala industrial e outros que fabricam
em uma escala menor e menos sofisticada (WHO, 2017).

A falsificação de medicamentos não se resume a uma classe terapêutica específica

(HURTADO; LASMAR, 2014). Dentre os produtos de baixa qualidade ou falsificados
(Figura 2), os medicamentos conhecidos como “medicamentos de estilo de vida”,
(medicamentos para tratamento da disfunção erétil, anabolizantes e anorexígenos),
constituem a quarta maior classe de medicamentos reportados à OMS no período de
2013 a 2017 e foram identificados em 37 países diferentes (WHO, 2017).

No Brasil, os medicamentos mais falsificados coincidem com aqueles mais

procurados pela população e de maior preço no mercado oficial. De acordo com
dados da perícia brasileira, os medicamentos que contêm inibidores da PDE-5,
utilizados para tratar a disfunção erétil, dentre eles, Viagra® (SLD, Pfizer) e Cialis®
(TAD, Eli Lilly) são os mais comumente falsificados no país, seguidos por esteroides
anabolizantes (AMES; SOUZA, 2012).
 28

Figura 2 – Número de notificações de medicamentos de qualidade inferior e falsificados

recebidos pela OMS no período entre 2013 e 2017, de acordo com a classe terapêutica.

Fonte: adaptado de WHO, 2017.

No estudo realizado por Hurtado e Lasmar (2014), foi determinado o panorama de

comercialização de medicamentos ilegais no Brasil por meio de um levantamento de
apreensões realizadas pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), no
período de 2007 a 2011. Dentre os medicamentos falsificados, destacou-se a
apreensão de medicamentos para o tratamento da disfunção erétil, responsáveis por
78% das apreensões. Outro fato importante é a apreensão conjunta de
medicamentos contrabandeados e falsificados, de modo que, em 49% das
apreensões, esses produtos foram fabricados pela indústria paraguaia, levando a
concluir que os produtos falsos muitas vezes são produzidos no exterior e adentram
no país por meio da fronteira (HURTADO; LASMAR, 2014).

Ames e Souza (2012) realizaram estudo retrospectivo a partir de informações de

laudos de medicamentos inautênticos do Sistema de Criminalística da Polícia
Federal (PF), datados de janeiro de 2007 a setembro de 2010, produzidos pelas
unidades periciais das Unidades Federativas brasileiras. Dentre os medicamentos
falsificados, 69% pertenciam à categoria dos inibidores da PDE-5, seguidos pelos
esteroides anabolizantes, inibidores de prostaglandinas e por outros medicamentos.
Além disso, 67% das apreensões incluíram medicamentos contrabandeados e,
cerca de 49% dos medicamentos contrabandeados eram de indústria paraguaia.
 29

3.3 Aplicação de técnicas analíticas em atividades forenses

A identificação de um medicamento falsificado ou contrabandeado é realizada por

meio de uma comparação entre o produto autêntico ou dados da literatura e o
produto questionado. A constatação da falsificação envolve uma sequência de
análises que iniciam com a avaliação detalhada de diferentes elementos existentes
nas embalagens e na forma farmacêutica, dentre as quais se destacam a avaliação
macroscópica das embalagens e bulas e dos padrões de impressão (fontes, figuras,
hologramas). Em seguida deve ser realizada a avaliação das características físicas
da forma farmacêutica (cor, marcações, medidas de dimensões e massa). Faz-se
necessário também, a utilização de técnicas analíticas que possibilitem a
caracterização da formulação, objetivando-se identificar e/ou quantificar o(s) IFA e
excipientes (ORTIZ, 2013).

Na avaliação química das amostras, é fundamental a identificação e a quantificação

do princípio ativo mencionado no rótulo do produto. Para isso, deve-se escolher
técnica(s) analítica(s) adequada(s) considerando-se as propriedades e estabilidades
física, química e físico-química das substâncias envolvidas (ORTIZ; ANTUNES;
LINDEN, 2010).

Existem diversas técnicas de análise utilizadas para caracterizar medicamentos e

verificar sua autenticidade, desde técnicas mais simples, como as colorimétricas e
análise termodinâmica, até técnicas mais avançadas, como cromatografia líquida de
alta/ultra eficiência, cromatografia a gás (CG), eletroforese capilar,
espectrofotometria no infravermelho, espectroscopia Raman, espectrometria de
massas, espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) e técnicas
combinadas (KRAKOWSKA et al., 2016).

Encontram-se descritos na literatura estudos que contemplam a análise de

compostos orgânicos e inorgânicos em medicamentos ilegais contendo SLD e TAD,
utilizando diferentes técnicas de análise. Esses estudos indicam que alguns dos
medicamentos avaliados não apresentam o IFA, possuem quantidade inadequada
da substância ativa, alegam conter SLD, mas, na verdade, têm TAD ou uma mistura
desses IFA e/ou apresentam grandes quantidades de contaminantes (COELHO;
 30

LISBOA, 2017; ORTIZ et al., 2011; ORTIZ et al., 2012a; ORTIZ et al., 2012b; ORTIZ
et al., 2013; VEJI et al., 2008).

Dentre as técnicas mais utilizadas em análises farmacêuticas e forenses, encontra-

se a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, em inglês High performance
liquid chromatography (HPLC), uma vez que é considerada uma técnica de
referência para análises qualitativas e quantitativas. Sistemas de HPLC podem estar
equipados com diferentes tipos de detectores que oferecem variáveis tipos de
respostas, tais como detector ultravioleta (UV) e espectrômetro de massas (MS)
(KRAKOWSKA et al., 2016).

3.3.1 Métodos cromatográficos com detecção no ultravioleta para

determinação de SLD e TAD

Nas Farmacopeias Americana (THE UNITED, 2019), Europeia (THE EUROPEAN,

2017) e Britânica (BRITISH, 2014) encontram-se descritas monografias para os IFA
citrato de SLD e TAD. Entretanto, apenas na Farmacopeia Americana há
monografias para a forma farmacêutica comprimidos. Na Tabela 1, encontra-se um
resumo dos parâmetros e métodos de análise farmacopeicos existentes para a
determinação do teor do SLD e da TAD.

O método para quantificação da cedência (teste de dissolução) de comprimidos

contendo SLD utiliza espectrofotometria na região ultravioleta, com detecção em 290
nm. O método de uniformidade de conteúdo para comprimidos contendo TAD
também emprega a quantificação por espectrofotometria na região ultravioleta, mas
com detecção em 285 nm (THE UNITED, 2019).

Ao analisar a Tabela 1 é possível perceber que, em todos os métodos analíticos

compendiais para determinação de SLD, utiliza-se coluna com sílica ligada a grupos
octadecilsilano e fase aquosa constituída por solução de trietilamina (TEA) com pH
ajustado para 3,0, enquanto que para a TAD, utilizam-se colunas com sílica ligada a
gupos octilsilano e fase aquosa acidificada com ácido trifluoroacético. Em relação à
detecção, opera-se em 290 nm para quantificação do SLD e em 285 nm para a TAD.
 31

Tabela 1 – Métodos farmacopeicos, por HPLC-UV, para determinação do teor de SLD e TAD em IFA e comprimidos.
Vazão Volume de Temperatura Detecção
Farmacopeia Teste / Matriz Fase móvel Fase estacionária
(mL/min) injeção (µL) do forno (ºC) (nm)
Solução aquosa de
Americana 42ª edição (THE
TEA 0,7% (v/v) pH
UNITED, 2019) Doseamento / C18, 150 x 3,9 mm,
3,0, metanol e 1,0 20 30 290
SLD IFA 5 µm
acetonitrila 58:25:17
Europeia 9 ed.
(v/v)
(THE EUROPEAN, 2017)
Solução aquosa de
Doseamento / TFA 0,1% (v/v) e C8, 250 x 4,6 mm,
Britânica 2014 1,5 20 40 285
TAD IFA acetonitrila 55:45 3,5 µm
(BRITISH, 2014)
(v/v)
Solução aquosa de
Doseamento / TEA 0,7% (v/v) pH
C18, 150 x 3,9 mm,
SLD 3,0, metanol e 1,0 20 30 290
5 µm
comprimidos acetonitrila 58:25:17
(v/v)
Americana 42ª edição (THE
Doseamento /
UNITED, 2019) Água, acetonitrila, e C8, 150 x 4,6 mm,
TAD 1,0 10 35 285
TFA 65:35::0,1 (v/v) 3,5 µm
comprimidos
Dissolução /
Água e metanol e C8, 50 x 4,6 mm,
TAD 2,0 50 40 225
50:50 (v/v) 3,5 µm
comprimidos
Legenda: TEA = trietilamina; TFA = ácido trifluoroacético.
 32

Além dos compêndios oficiais, há na literatura métodos cromatográficos para

determinação simultânea de SLD e TAD em medicamentos, com a utilização de
HPLC-UV (FIDAN, BAKIRDERE, 2016; ORSI et al., 2009; YANG et al. 2010).

Devido à possibilidade de separar vários componentes durante a análise de

amostras, métodos cromatográficos têm precedência sobre os métodos
convencionais de análise. A HPLC é considerada a técnica mais desenvolvida,
difundida e empregada em laboratórios analíticos de indústrias farmacêuticas e
químicas (AL-SAYAH et al., 2008). Porém, a demanda por métodos de análise mais
rápidos e com elevada eficiência vem crescendo significativamente.

Diante dessas necessidades, alternativas estão sendo desenvolvidas e aplicadas em

busca da redução do tempo e melhoria da eficiência de análises realizadas por
HPLC. Uma delas é a UHPLC, na qual as partículas porosas constituintes da fase
estacionária possuem diâmetro médio inferior a 2 µm, proporcionando assim,
elevada eficiência cromatográfica e consequente ganho em resolução,
detectabilidade e rapidez (GUILLARME et al., 2010; PRADO, 2013).

O sistema cromatográfico utilizado na UHPLC é mais sofisticado, sendo capaz de

suportar pressões de até 15000 psi (cerca de 1000 bar). É equipado com detectores
com menor tempo de resposta, maior taxa de aquisição de dados e menor volume
interno da célula de detecção. Ademais, possui tubulações de menor comprimento e
diâmetro interno (MARTINS, 2012; AMPARO, 2011; NGUYEN et al., 2006). A
UHPLC pode apresentar melhor relação custo-benefício a médio ou longo prazos,
além da possibilidade de minimizar o impacto ambiental e ocupacional decorrente do
uso de menores volumes de reagentes e amostra (NOGUEIRA et al., 2011; WREN;
TCHELITCHEFF, 2006).

Uma outra possibilidade que traz como benefício a redução do tempo de análise e
melhora na eficiência cromatográfica, é a utilização de colunas com partículas
superficialmente porosas, também conhecidas como núcleo fundido. Essas são
constituídas por um núcleo sólido não poroso e impermeável, normalmente de 1,7
μm de diâmetro, revestido por uma parte externa porosa com espessura geralmente
de 0,5 μm (DESTEFANO; LANGLOIS; KIRKLAND, 2008).
 33

Em comparação com partículas porosas de diâmetros totalmente semelhantes, o

caminho de difusão é muito mais curto, uma vez que o interior do núcleo é sólido, ou
seja, é impenetrável pelos analitos. O menor caminho de difusão facilita a
transferência de massa e reduz o caminho intra-partículas, o que contribui para que
o efeito de alargamento de bandas seja minimizado. Outra característica a ser
destacada é a distribuição homogênea de partículas de mesmo tamanho no leito
cromatográfico, reduzindo o efeito de caminhos múltiplos (ALI et al., 2012;
GUILLARME et al., 2010).

São encontrados alguns métodos para quantificação de SLD e/ou TAD em

medicamentos ilegais utilizando UHPLC-UV. Dentre eles, pode-se citar o estudo
realizado por Sacré e colaboradores (2011), que desenvolveram um método rápido
para identificar e quantificar três inibidores da PDE-5 (SLD, TAD e vardenafila) e
cinco análogos (acetildenafila, hidroxiacetilsildenafila, dimetilsildenafila,
pseudovardenafila, aminotadalafila e trans-tadalafila), que podem ser encontrados
em medicamentos falsificados. Para isso, foi utilizada coluna C18 (100 x 2,1 mm, 1,7
µm), fase móvel constituída por acetonitrila e tampão formiato de amônio 10 mM pH
3,5 em modo de eluição gradiente, com tempo de corrida de 4,5 minutos. Ortiz,
Antunes e Linden (2010) desenvolveram e validaram um método para determinação
simultânea de SLD e TAD e o aplicaram em comprimidos originais e encaminhados
para exame pericial pela PF. Neste método foi utilizada coluna C18 (50 x 2,1 mm, 1,7
µm), mantida a 60 ºC, fase móvel constituída por tampão fosfato 10 mM (pH 2,3) e
acetonitrila em eluição isocrática e vazão da fase móvel de 0,7 mL/min. Os analitos
foram detectados em 290 nm e a corrida cromatográfica teve duração de 1,5
minutos.

Esses métodos trazem a vantagem de serem muito rápidos e eficientes na

separação de SLD e TAD. Entretanto, nenhum deles caracteriza-se por ser
indicativo de estabilidade, o qual é definido como sendo capaz de mensurar com
precisão e exatidão o(s) princípio(s) ativo(s), sem a interferência dos produtos de
degradação, impurezas de processo, excipientes ou outras potenciais impurezas
(FDA, 2000). Os métodos indicativos de estabilidade são desenvolvidos a partir de
estudos de degradação forçada, que permitem a geração de produtos de
degradação por meio da exposição do IFA e produto acabado a condições de
 34

estresse, como por exemplo, luz, temperatura, calor, umidade, hidrólise ácida/
básica e oxidação, entre outras (BRASIL, 2015).

Na literatura foram encontrados alguns métodos que investigam a estabilidade

individualmente do SLD (ABD-ELBARY et al., 2004; DARAGHMEH et al., 2001;
LIEW; PEH, 2018; SEGALL et al., 2000; TAMBE; DEODHAR; PRAKYA, 2016) e da
TAD (PATEL; PATEL, 2014; RAO et al., 2008; SATHEESH et al., 2013, SEN;
PANTEL, 2015), os quais são apresentados na Tabela 2.

Em todos esses métodos foi empregada a HPLC-UV como técnica de análise, com
exceção dos métodos descritos por Tambe, Deodhar e Prakya (2016) e Satheesh et
al. (2013), nos quais foi utilizada UHPLC-UV.

Ao avaliar a Tabela 2, verifica-se que os resultados referentes à formação de

produtos de degradação nas condições de estresse são divergentes nos artigos
encontrados. Isto pode ser justificado, pelo fato de os IFA serem provenientes de
diferentes fornecedores e rotas de síntese e/ou as formulações serem constituídas
por variados excipientes. Além disso, não há uma padronização das condições
(como, por exemplo, concentração, temperatura e tempo) de exposição aos agentes
degradantes.

Apesar de existirem métodos indicativos de estabilidade individuais para SLD e TAD

utilizando-se HPLC e UHPLC, não foi encontrado na literatura um estudo completo
de estabilidade, incluindo degradação forçada, identificação de produtos de
degradação e desenvolvimento de método indicativo de estabilidade rápido e eficaz
para quantificação simultânea desses fármacos na presença de seus produtos de
degradação por UHPLC-UV, que possa também ser aplicado nos testes de
qualidade de medicamentos originais e ilegais.
 35

Tabela 2 – Métodos indicativos de estabilidade para SLD e TAD encontrados na literatura.

Técnica Identificação
Referência Analito(s) e matriz Agentes degradantes Condições com formação de PD
analítica dos PD
Ambos os fármacos foram suscetíveis à
SLD e hidróxido de Meios ácido (HCl 3 M TA 3 h), alcalino (NaOH 3 M TA 3 oxidação e o conteúdo dos IFA reduziu
LIEW; PEH, 2018 dapoxetina IFA e HPLC-UV h), oxidativo (H2O2 35% v/v 3 h), luz (cabine de luz UV ligeiramente nas condições ácida e NA
comprimidos 24 h) e temperatura (80 ºC 2 h) alcalina, mas manteve-se estável sob
luz UV e calor
Foram
apresentadas
TAMBE; SLD e hidróxido de Meios ácido (HCl 1 M 90 ºC 6 h), alcalino (NaOH 1 M 90 Formaram-se PD provenientes do SLD
UHPLC- algumas
DEODHAR; dapoxetina IFA e ºC 6 h) e neutro (H2O TA 24 h), estresse fotolítico (UV em meios ácido, alcalino, oxidativo e
UV-MS possíveis
PRAKYA, 2016 comprimidos 1,2 milhões lux.h) e térmico (calor seco 90 ºC 6 h) sob aquecimento
estruturas dos
PD
ABD-ELBARY et SLD IFA e pH (2,5; 4 e 8) e temperatura (60 ºC e 80 ºC) durante 3 SLD degradou em todas as condições e
HPLC-UV NA
al., 2004 comprimidos dias houve a formação de um PD
SLD e substâncias
DARAGHMEH et Pequena fotodegradação (formação de
relacionadas em HPLC-UV Fotodegradação (luz direta por 6 dias) NA
al., 2001 dois PD)
IFA e comprimidos
Meios ácido (HCl 1 M sob refluxo por 15 min), alcalino Formaram-se dois PD em meio ácido,
(NaOH 1 M sob refluxo 15 min), neutro (H2O sob refluxo um PD em meio alcalino, três PD em
SEGALL et al.,
SLD comprimidos HPLC-UV 15 min), oxidativo (H2O2 30% v/v sob refluxo por 15 meio oxidativo, sendo um majoritário, NA
2000
min), estresse fotolítico (luz do dia 24 h) e térmico (calor um PD em meio neutro e a partir do
seco 110 ºC 24 h) estresse fotolítico com o mesmo tR
Meios ácido (HCl 1 M HCl a 40 ºC, 60 ºC e 80 ºC),
SEN; PATEL, Degradação nos meios ácido, alcalino e
TAD IFA HPLC-UV alcalino (NaOH 1 M a 40 ºC, 60 ºC e 80 ºC) e oxidativo NA
2015 oxidativo
(H2O2 30% v/v)
TAD e A TAD apresentou degradação extensa
PATEL; PATEL, Luz solar, calor (refluxo), ácido (HCl 1 M), base (NaOH
ambrisentana em HPLC-UV sob condições alcalinas e degradou em NA
2014 1 M) e oxidação (H2O2 30% v/v)
comprimidos meio ácido
Meios ácido (HCl 1 M HCl a 80 ºC por 12 h), alcalino
NaOH 1 M a 80 ºC por 12 h), neutro (solução aquosa
SATHEESH et al., TAD em
UHPLC-UV aquecida a 80 ºC por 12 h), oxidativo (H2O2 3% v/v a 35 Degradação nos meios ácido e oxidativo NA
2013 comprimidos
ºC, por 12 h), estudo de fotodegradação (UV a 254 nm
por 2 dias), aquecimento a 105 ºC por 2 dias
Identificação do
Meios ácido (HCl 0,1 M HCl a 27 ºC por 48 h e HCl 1 M
PD proveniente
a 70 ºC por 3 h), alcalino NaOH 0,1 M a 27 ºC por 48 h),
da hidrólise em
neutro (solução aquosa aquecida a 70 ºC por 3 h),
TAD IFA e Apresentou PD em meio ácido, alcalino meios ácido e
RAO et al., 2008 HPLC-UV oxidativo (H2O2 6% e 20% v/v por 48 h à TA). Estudo de
comprimidos e oxidativo alcalino
fotodegradação (1,2 milhões lux.h e energia UV de 200
utilizando tempo
watt hm2). O IFA foi exposto ao aquecimento a 40 ºC
de retenção
durante 10 dias e a 60 ºC durante 7 dias
(isômero TAD)
Legenda: NA = não avaliado; PD = produto de degradação; TA = temperatura ambiente.
 36

3.4 Controle de qualidade dos medicamentos

A qualidade, segurança e efetividade dos medicamentos são os pilares para o

sucesso de um tratamento. Para garantir a qualidade dos medicamentos, devem ser
seguidos procedimentos padrão e requisitos mínimos durante a sua fabricação,
visando sempre o cumprimento das Boas Práticas de Fabricação de Medicamentos
(BPF). As BPF, por sua vez, podem ser definidas como um conjunto de ações que
determinam que os produtos são consistentemente produzidos e controlados, com
padrões de qualidade apropriados para o uso pretendido e requerido pelo registro
sanitário (BRASIL, 2019).

A falsificação e contrabando de medicamentos representam alto risco sanitário, uma

vez que os mesmos são produzidos sem seguir os padrões de qualidade e
segurança necessários. Além disso, não são submetidos aos testes de qualidade e
efetividade exigidos pela autoridade regulatória, não havendo certeza sobre a dose,
princípio ativo e impurezas. Tais produtos podem não produzir os efeitos
terapêuticos desejados e/ou provocar o aparecimento de reações clínicas
inesperadas (AMES; SOUZA, 2012).

Tendo em vista a necessidade de conhecer o grau de qualidade dos comprimidos

falsificados, adulterados ou contrabandeados contendo SLD e TAD aos quais os
pacientes estão tendo acesso, faz-se necessária uma avaliação completa e
detalhada das características físico-químicas desses medicamentos. O controle de
qualidade faz parte das BPF e, dentre os principais testes de qualidade físico-
químico aos quais os comprimidos devem ser submetidos, citam-se os testes de
identificação, doseamento, uniformidade de doses unitárias, dissolução e perfil de
dissolução.

Os testes de identificação são ensaios que permitem a confirmação da presença do

IFA na formulação. O doseamento é realizado para quantificar o IFA no
medicamento. Já por meio do teste de uniformidade de doses unitárias é possível
avaliar a quantidade de IFA em unidades individuais do lote e verificar se esta é
uniforme entre as unidades testadas. O teste de dissolução possibilita determinar a
quantidade de substância ativa dissolvida no meio de dissolução quando o produto é
 37

exposto à ação de aparelhagem específica, sob condições experimentais descritas

na monografia. E o perfil de dissolução, por sua vez, é definido como ensaio
analítico (in vitro) com coletas em múltiplos pontos, que permite a construção da
curva de porcentagem do IFA dissolvido em função do tempo (FARMACOPEIA,
2019; GIL, 2010).

Conforme descrito no item 3.3.1 (página 30), nas monografias farmacopeicas para
SLD e TAD são utilizadas diferentes técnicas e métodos para as análises físico-
químicas dos comprimidos. Dessa forma, considera-se relevante o desenvolvimento
de um método analítico único, validado em uma faixa que permita sua utilização
tanto no teste de doseamento e uniformidade de conteúdo, quanto no teste de
dissolução e que ainda seja capaz de quantificar os analitos na presença de
potenciais produtos de degradação/impurezas de maneira rápida, para agilizar e
reduzir os custos envolvidos na realização dessas análises.
 38

4 MATERIAIS

4.1 Substâncias químicas de referência (SQR), IFA e placebo

• As seguintes SQR foram utilizadas no presente estudo: citrato de sildenafila
SQR (Farmacopeia Europeia, lote 1.1, pureza de 98,80%) e tadalafila SQR
(Farmacopeia Europeia, lote 2.0, pureza de 99,90%).
• Os seguintes IFA também foram usados: citrato de sildenafila IFA
(disponibilizado pela Farmácia Amphora, de origem indiana, comercializado
pela Fagron, lote 15116589B e pureza de 98,83%) e tadalafila IFA
(disponibilizado pela Farmácia Vivence, de origem indiana, lote 2982 e pureza
de 99,02%).
• Mistura de excipientes (placebo) utilizada na validação do método analítico.
Para o seu preparo, estimou-se a composição quantitativa dos excipientes a
partir da constituição qualitativa descrita nas bulas dos medicamentos
referência Viagra® e Cialis®, e de informações obtidas na literatura. Os
componentes, respectivas funções farmacotécnicas e proporções estimadas
de cada excipiente são apresentados na Tabela 3.

Tabela 3 – Funções farmacotécnicas e proporções estimada dos excipientes utilizados na

fabricação dos comprimidos Viagra® e Cialis®.
Proporção estimada (%)1
Excipiente Função farmacotécnica
Viagra® Cialis®
Celulose microcristalina Diluente 50,0 40,0
Croscarmelose sódica Desintegrante 2,0 2,0
Agente de revestimento,
Dióxido de titânio - 2,0
opacificador e pigmentador
Estearato de magnésio Lubrificante 2,0 2,0
Fosfato de cálcio dibásico anidro Diluente 19,8 -
Agente de revestimento e
Opadry azul
® 2 3,0 -
corante
Hidroxipropilcelulose Agente de revestimento - 2,0
Hipromelose Agente de revestimento - 0,5
Lactose monoidratada Diluente - 44,0
Laurilsulfato de sódio Lubrificante - 1,0
Agente de revestimento,
Opadry transparente
® 1,0 -
umectante e plastificante
Óxido de ferro amarelo Corante - 0,5
Triacetina Umectante e plastificante - 0,5
1A proporção estimada de cada excipiente foi baseada no Handbook of Pharmaceutical Excipients

(ROWE et al., 2009) e na proporção média de citrato de SLD e TAD nos comprimidos, sendo 22,2% e
5,5% respectivamente.
2Opadry® azul: hipromelose, lactose, triacetina, índigo carmin alumínio laca e dióxido de titânio.
3Opadry® transparente: hipromelose e triacetina.
 39

4.2 Comprimidos originais e apreendidos

• Comprimidos originais, registrados na ANVISA, contendo 50 mg de sildenafila
(equivalente a 70,24 mg de citrato de sildenafila). Foram utilizados dois lotes
do medicamento referência (codificados como Viagra 1 e 2) e dois lotes de
medicamentos genéricos fabricados por diferentes indústrias farmacêuticas
(codificados como genérico SLD 1 e 2).
• Comprimidos originais, registrados na ANVISA, contendo 20 mg de tadalafila.
Foram utilizados um lote do medicamento referência (Cialis) e três lotes de
medicamentos genéricos fabricados por diferentes indústrias farmacêuticas
(codificados como genérico TAD 1, 2 e 3).
• Dez diferentes lotes de comprimidos apreendidos e disponibilizados pela
Polícia Federal (PF) e pela Polícia Civil de Minas Gerais (PCMG) suspeitos de
conter SLD e/ou TAD com provável proveniência de falsificação ou
contrabando.

4.3 Reagentes
• Água ultrapura.
• Reagentes grau analítico: ácido clorídrico, ácido fórmico, álcool etílico
absoluto, dodecil sulfato de sódio/laurilsulfato de sódio, sulfato de cobre
pentahidratado, trietilamina e uracila Sigma Aldrich (Saint Louis, EUA), ácido
acético glacial Neon (Suzano, Brasil), ácido trifluoroacético Tedia Company
(Fairfield, EUA), formiato de amônio Merck (Darmstadt, Alemanha), hidróxido
de sódio Synth e peróxido de hidrogênio Synth (Diadema, Brasil).
• Solventes grau HPLC: acetonitrila J.T. Baker (Xalostoc, México), acetonitrila
Merck (Darmstadt, Alemanha), acetonitrila Honeywell (Muskegon, EUA) e
metanol Sigma Aldrich (Saint Louis, EUA).

4.4 Materiais, vidrarias e instrumentos

• Coluna cromatográfica Phenomenex, Kinetex C18 (50 x 2,1 mm, 1,7 µm).
• Frasco tipo vial com tampa de rosca e septos de silicone.
• Filtros de seringa de PVDF com 0,45 µm e 0,22 µm de tamanho de poro.
• Kit para filtração a vácuo.
 40

• Membrana de celulose regenerada para filtração com 22 mm de diâmetro e

poros de 0,22 µm Sartorius Stedim Biotech.
• Paquímetro Mitutoyo 500-143B.
• Pipetas automáticas.
• Ponteiras para uso em pipetas automáticas.
• Seringas de plástico de 5 mL e 10 mL.

4.5 Equipamentos
• Aparelho de ultrassom BRANSON 3210R-MT.
• Balança analítica SARTORIUS modelo BP211D.
• Balança semi-analítica Ohaus TP2KS
• Banho-maria FULL GAUGE TIC-17C.
• Bomba de vácuo Weg B480794.
• Câmara de fotoestabilidade equipada com lâmpadas distintas para emissão
de radiação visível e ultravioleta.
• Centrífuga Jouan B 4i.
• Dissolutor Hanson SR 8 Plus.
• Espectrofotômetro FTIR PerkinElmer modelo Spectrum One com software
Spectrum.
• Espectrofotômetro UV/VIS Vankel modelo Cary 50.
• Estufa NABERTHERM TR 60.
• Potenciômetro METROHM 827 pH Lab.
• Sistema de purificação de água MILLIPORE DIRECT Q3 UV.
• Sistema UHPLC-Q-TOF-MS composto por cromatógrafo a líquido de ultra
eficiência Agilent 1290 (amostrador, injetor automático, desgaseificador,
bomba quaternária, forno de colunas e detector de arranjo de diodos - DAD) e
espectrômetro de massas Agilent 6540 UHD, equipado com fonte de
ionização electrospray e analisador do tipo híbrido - quadrupolo e tempo-de-
voo - e software MassHunter.
• Sistema UHPLC-UV composto por cromatógrafo a líquido de ultra eficiência
WATERS ACQUITY UPLC (amostrador, injetor automático, desgaseificador,
bomba quaternária, forno de colunas e detector UV) e software Empower.
• Softwares Action Stat®, Microsoft Excel® e STATISTICA®
 41

5 MÉTODOS

5.1 Determinação da solubilidade dos IFA SLD e TAD

A solubilidade de cada um dos IFA (SLD e TAD) foi avaliada, separadamente, em

água, álcool etílico absoluto, acetonitrila, metanol, ácido fórmico 0,1% (v/v) e em
mistura de acetonitrila e água 70:30 (v/v).

Para este procedimento, pesaram-se, separadamente, cerca de 10 mg de cada um

dos IFA e transferiram-se para erlenmeyers de 125 mL. Alíquotas crescentes do
solvente foram adicionadas até a completa solubilização do IFA. Após cada adição
do solvente, agitou-se o erlenmeyer manualmente e, em seguida, este foi deixado
em banho de ultrassom durante 1 minuto. Nos casos em que um volume de 100 mL
de solvente não provocou solubilização, classificou-se o IFA como não solúvel nesse
determinado solvente. O teste foi realizado em temperatura ambiente.

5.2 Identificação por espectrofotometria no infravermelho

Para a identificação dos IFA utilizados neste trabalho, obtiveram-se os espectros de

absorção na região do infravermelho do SLD e da TAD IFA e das respectivas SQR
na faixa de 4000 a 650 cm-1 utilizando-se equipamento com acessório de refletância
total atenuada, em inglês Attenuated total reflection (ATR). Os espectros foram
comparados para confirmar a identidade das amostras.

5.3 Determinação dos máximos de absorção na região do ultravioleta do SLD e

da TAD

Com o objetivo de determinar os comprimentos de onda nos quais ocorrem os

máximos de absorção do SLD e da TAD na região do ultravioleta, os espectros de
absorção foram obtidos na faixa de 200 a 400 nm para soluções individuais,
contendo 8 µg/mL de citrato de SLD SQR e 5 µg/mL de TAD SQR preparadas em
acetonitrila e água 50:50 (v/v). A solução branco foi constituída por uma mistura de
acetonitrila e água nas mesmas proporções. A partir dos espectros de varredura
 42

obtidos para o SLD e a TAD determinou-se o comprimento de onda de detecção a

ser utilizado no método analítico.

5.4 Estudos de degradação forçada

Com o objetivo de desenvolver método seletivo para os IFA SLD e TAD e para seus
possíveis produtos de degradação/impurezas, realizaram-se inicialmente testes
preliminares de degradação forçada, submetendo os IFA às condições ácida,
alcalina, neutra, presença de íons metálicos, degradação térmica, fotolítica e
oxidação com peróxido de hidrogênio. As condições de degradação, tais como a
concentração do agente estressante, bem como o tempo e temperatura de
exposição foram reduzidas ou aumentadas gradativamente até se conseguir a
porcentagem de degradação desejada (mínimo de 10%) ou até que se alcançasse
uma condição considerada extrema de estresse e, portanto, não mais condizente
com situações reais às quais os fármacos e medicamentos poderiam ser expostos
(BAERTSCHI; ALSANTE; REED, 2011; BRASIL, 2015).

Os agentes estressantes, diluentes e fase móvel empregados no teste de

degradação forçada também foram avaliados isoladamente, visando identificar os
respectivos sinais cromatográficos, para que esses não fossem confundidos com
produtos de degradação/impurezas. O estudo de degradação foi conduzido tanto
com os IFA isolados, quanto juntos na mesma solução.

As amostras degradadas foram utilizadas na otimização do método analítico e então

ajustaram-se as condições cromatográficas, de forma a se obter separação
adequada entre os picos dos analitos e produtos de degradação formados.

O preparo das soluções amostra de IFA submetidas à degradação forçada e das

soluções padrão utilizadas para a quantificação de SLD e TAD remanescentes após
a degradação são descritas a seguir.
 43

5.4.1 Soluções de degradação

As exposições aos agentes degradantes foram realizadas conforme recomendado

por Baertschi, Alsante e Reed (2011). Para o preparo das soluções de degradação
em meio neutro, ácido, alcalino, oxidativo e com íons metálicos, preparou-se
inicialmente soluções estoque dos IFA isolados e misturados contendo 1400 µg/mL
de citrato de SLD e 400 µg/mL de TAD utilizando-se mistura de acetonitrila e água
70:30 (v/v) (Diluente 1) como diluente.

Em seguida, foram preparadas as soluções de degradação, adicionando-se 5 mL

dos agentes estressantes (água ultrapura, ácido clorídrico 2 M, hidróxido de sódio
0,02 M, peróxido de hidrogênio 6% (v/v) e sulfato de cobre 0,1 M) a 5 mL das
soluções estoque dos IFA. Para cada condição de estresse, foram preparadas
duplicatas, de modo que uma réplica foi mantida à temperatura ambiente e a outra
mantida em banho-maria a 50 ⁰C.

Alíquotas de 1 mL das soluções de degradação foram retiradas em diferentes

tempos de coleta e transferidas para balão volumétrico de 10 mL. O volume foi
completado com mistura de acetonitrila e água 15:85 (v/v) (Diluente 2),
homogeneizou-se, filtrou-se utilizando-se filtro de seringa de 0,22 µm de tamanho de
poro e transferiu-se para vial.

Para o preparo das amostras provenientes da degradação térmica, os IFA foram

pesados, colocados em pesa-filtros e expostos a 60 ºC durante 30 dias em uma
estufa. Para a exposição à fotodegradação, os IFA foram transferidos para placas de
petri e submetidos à degradação em câmara de fotoestabilidade equipada com
lâmpadas distintas para emissão de radiação visível e ultravioleta. A exposição foi
de três ciclos a mais do que é exigido nas legislações de fotoestabilidade (ICH Q1B,
1996), ou seja, as amostras foram expostas a 3,6 milhões lux.h (visível) e 600
watt.h/m2 (ultravioleta). A partir das amostras expostas à temperatura e luz,
prepararam-se soluções com concentração teórica de 70 µg/mL de citrato de SLD e
20 µg/mL de TAD utilizando-se os Diluentes 1 e 2.
 44

5.4.2 Soluções padrão de SLD e TAD

Para a quantificação dos IFA remanescentes nas amostras degradadas, utilizou-se

curva analítica construída por Soluções padrão a 20%, 100% e 180% das
concentrações de trabalho (70 µg/mL para citrato de SLD e 20 µg/mL para TAD)
preparadas a partir de uma Solução padrão estoque, que foi obtida pesando-se,
exatamente, cerca de 17,5 mg de citrato de SLD SQR e 5 mg de TAD SQR e
transferindo-se para balão volumétrico de 25 mL. Adicionaram-se cerca de 20 mL do
Diluente 1 e deixou-se em banho de ultrassom durante 10 minutos. Após esfriar,
completou-se o volume com o Diluente 1 e homogeneizou-se, obtendo-se solução a
700 µg/mL de citrato de SLD e 200 µg/mL de TAD.

A partir da Solução padrão estoque, prepararam-se as Soluções padrão nas

concentrações apresentadas na Tabela 4, utilizando-se Diluente 2 para completar o
volume.

Tabela 4 – Concentrações das Soluções padrão para preparo da curva analítica.

Concentração citrato de SLD
Nível de concentração Concentração TAD (µg/mL)
(µg/mL)
20% 14 4
100% 70 20
180% 126 36

5.5 Desenvolvimento do método para quantificação simultânea de SLD, TAD e

potenciais produtos de degradação por UHPLC-UV

O desenvolvimento do método para quantificação simultânea de SLD e TAD por

UHPLC-UV foi realizado utilizando-se as amostras provenientes do estudo de
degradação forçada.

Iniciou-se o desenvolvimento com a realização de gradientes exploratórios com fase

móvel constituída por acetonitrila e ácido fórmico 0,1% (v/v), com a finalidade de
conhecer a retenção dos analitos. Em seguida, vários métodos isocráticos foram
propostos, testando-se diferentes condições, conforme apresentado na Tabela 5, na
tentativa de obter resolução satisfatória entre SLD, TAD e os produtos de
degradação formados.
 45

Como não foi obtida separação satisfatória entre os analitos de interesse com a
eluição isocrática, partiu-se para a realização de testes utilizando-se eluição em
gradiente. Então, a partir dos resultados obtidos com o primeiro gradiente testado,
propôs-se diversas alterações no tempo e proporção do solvente orgânico, com a
finalidade de melhorar a resolução entre os picos.

Tabela 5 – Condições cromatográficas e variações das mesmas testadas durante o

desenvolvimento do método analítico.
Condição cromatográfica Variações testadas
Eluentes orgânico Acetonitrila e metanol
Ácido fórmico 0,1% (v/v); solução aquosa de trietilamina (TEA)
Eluentes aquosos 0,1% e 0,2% (v/v), pH 3.0; ácido trifluoroacético (TFA) 0,05% (v/v)
e ácido acético 0,1% (v/v).
Composição da fase móvel 20 a 40% de eluente orgânico
Vazão da fase móvel 0,1 a 0,8 mL/min
Temperatura do forno 25 a 50 ºC
Volume de injeção 1 a 5 µL
Frequência de aquisição do
5 e 10 pontos/segundo
detector

Optou-se pelo gradiente que produziu melhor separação entre os analitos e os picos
dos produtos (resolução de, no mínimo, 1,5 para o par crítico) e que levou a valores
adequados dos seguintes parâmetros cromatográficos: fator de retenção (k), fator de
cauda (Tf) e número de pratos teóricos (N).

As condições cromatográficas e o gradiente do método otimizado utilizando-se

UHPLC-UV e coluna com partículas superficialmente porosas para quantificação
simultânea de SLD, TAD e potenciais produtos de degradação estão descritas nas
Tabelas 6 e 7 respectivamente.

Tabela 6 – Resumo das condições cromatográficas definitivas do método analítico seletivo

para SLD, TAD e seus produtos de degradação utilizando UHPLC-UV.
Parâmetros Condições
Coluna Phenomenex®, Kinetex C18 (50 x 2,1 mm, 1,7 µm)
Composição da fase Acetonitrila:solução aquosa de trietilamina (TEA) 0,2% (v/v), pH 3,0
móvel ajustado com ácido fórmico - eluição em gradiente
Comprimento de onda 285 nm
Fluxo da fase móvel 0,3 mL/min
Gradiente Descrito na Tabela 7
Temperatura do forno 35 °C
Volume de injeção 5 µL
Frequência de aquisição 5 pontos/segundo
do detector
Tempo da corrida 7 min seguidos de 2 min para re-equilíbrio da coluna
 46

Tabela 7 – Gradiente definitivo do método analítico seletivo para SLD, TAD e seus produtos de
degradação utilizando UHPLC-UV.
Tempo A % (v/v) B % (v/v)
Eluição
(min) (TEA 0,2% (v/v), pH 3,0) (acetonitrila)
0 – 0,5 85% → 75% 15% → 25% Gradiente linear
0,5 – 2,0 75% 25% Isocrática
2,0 – 2,5 75% → 70% 25% → 30% Gradiente linear
2,5 – 6,5 70% 30% Isocrática
6,5 – 7,0 70% → 85% 30% → 15% Gradiente linear
7,0 – 9,0 85% 15% Re-equilíbrio

5.6 Otimização da etapa do preparo de amostra para os testes de determinação

de teor de SLD e TAD em comprimidos

Como o método analítico desenvolvido será aplicado para a realização dos testes de
doseamento e uniformidade de conteúdo de amostras originais e suspeitas de
falsificação ou contrabando, a etapa de preparo de amostra para realização desses
testes em comprimidos foi realizada por meio de um planejamento fatorial 24.

As variáveis independentes escolhidas para compor o planejamento foram:

composição do diluente (X1), tempo de extração no ultrassom (min) (X2),
procedimento para remoção de partículas (filtração/centrifugação) (X 3) e estabilidade
das soluções (X4). Os níveis avaliados são apresentados na Tabela 8. As demais
variáveis independentes que não foram escolhidas para compor o planejamento
fatorial tiveram seus valores fixados. As variáveis dependentes (respostas) avaliadas
foram as recuperações de SLD e TAD obtidas em cada experimento, calculadas
utilizando-se a seguinte equação:

Recuperação (%) = (concentração experimental / concentração teórica) x 100

Tabela 8 – Variáveis independentes avaliadas no planejamento fatorial 24 e os níveis

avaliados para cada uma delas.
Nível
Fator
Inferior (-) Superior (+)
Acetonitrila/água Acetonitrila/TEA 0,2% (v/v), pH 3,0
X1 - Composição do diluente*
Diluentes 1 e 2 Diluentes 3 e 4
X2 - Tempo de extração no
10 min 20 min
ultrassom
Filtração Centrifugação
X3 - Remoção de partículas
(PVDF, 0,45 µm de poro) (2209 x g por 10 min)
X4 - Estabilidade das soluções Tempo zero (início) 24 h
*Os diluentes foram constituídos por mistura de acetonitrila e água 70:30 (v/v) (Diluente 1);
acetonitrila e água 15:85 (v/v) (Diluente 2); acetonitrila e TEA 0,2% (v/v), pH 3,0 70:30 (v/v) (Diluente
3); acetonitrila e TEA 0,2% (v/v), pH 3,0 15:85 (v/v) (Diluente 4).
 47

As soluções amostra contendo placebo, SLD IFA e TAD IFA foram preparadas de
maneira a reproduzir a matriz experimental do planejamento fatorial 24 sendo
realizados 16 experimentos, conforme descrito a seguir: transferiu-se quantidade
dos placebos de Viagra® e Cialis® presentes em 1/4 do peso médio dos comprimidos
(61,54 mg de placebo de Viagra® e 86,05 mg de placebo de Cialis®) para balões
volumétricos de 50 mL. Em seguida adicionaram-se a cada balão, cerca de 35,12
mg de citrato de SLD e 10 mg de TAD, 40 mL do Diluente 1 ou 3 e deixou-se em
banho de ultrassom durante 10 ou 20 minutos. Em seguida, completou-se o volume
com o Diluente 1 ou 3 e procedeu-se à filtração utilizando-se filtro de seringa de 0,45
µm de tamanho de poro ou centrifugou-se a 2209 x g durante 10 minutos.
Pipetaram-se 2,5 mL do filtrado ou do sobrenadante e transferiu-se para balão
volumétrico de 25 mL. Completou-se o volume com Diluente 2 ou 4 e
homogeneizou-se. Filtrou-se com filtro de seringa de 0,22 µm de tamanho de poro e
transferiu-se para vial. As soluções amostra preparadas foram analisadas
imediatamente após o preparo (tempo zero) e após 24 horas.

Para a determinação da recuperação, prepararam-se duas Soluções padrão,

contendo 70 µg/mL e 20 µg/mL de citrato de SLD e TAD respectivamente, uma delas
utilizando-se mistura de acetonitrila e água (Diluentes 1 e 2) e outra utilizando-se
mistura de acetonitrila e TEA 0,2% (v/v), pH 3,0 (Diluentes 3 e 4).

A recuperação de cada solução amostra foi obtida, os efeitos principais e de

segunda ordem foram calculados como as diferenças entre médias no nível superior
(+) e médias no nível inferior (-) para cada variável analisada, o erro foi estimado e a
significância dos efeitos foram obtidas, com 95% de confiança (BARROS NETO;
SCARMINIO; BRUNS, 2001).

5.7 Validação do método analítico

O método desenvolvido (Tabelas 6 e 7, páginas 45 e 46) foi validado de acordo com

as recomendações presentes na Resolução RDC nº 166/2017 da ANVISA (BRASIL,
2017), no Guia da International Conference on Harmonisation of Technical
Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use Q2(R1) (ICH)
(ICH, 2005), nas Orientações sobre validação de métodos de ensaios químicos
 48

(DOQ-CGCRE-008) (INMETRO, 2018) e nos procedimentos de validação

intralaboratorial definidos por Souza (2007) e Souza e Junqueira (2005). Todos os
cálculos foram realizados com auxílio do programa Microsoft Excel® e do software
estatístico Action Stat®.

5.7.1 Adequabilidade do sistema

Para verificar a adequabilidade do sistema cromatográfico e comprovar que o tempo

proposto de 2 minutos é suficiente para o re-equilíbrio da coluna, preparou-se uma
solução padrão a 100% das concentrações dos fármacos, conforme descrito no item
5.4.2 (página 44), e a mesma foi injetada seis vezes consecutivas no cromatógrafo.
Em seguida avaliou-se os seguintes parâmetros para os picos dos analitos: desvio
padrão relativo (DPR) da área sob o pico (DPR área), do tempo de retenção (DPR
tR), fator de cauda (Tf) e fator de retenção (k).

5.7.2 Seletividade

A seletividade do método foi avaliada em relação aos excipientes das formulações e

em relação aos produtos provenientes da degradação do SLD e da TAD.

Para a verificação da seletividade em relação aos produtos de degradação, os IFA

SLD e TAD foram expostos a estudo de degradação forçada e as amostras foram
injetadas utilizando-se o método analítico desenvolvido e otimizado. Todos os picos
deveriam estar separados com uma resolução mínima de 1,5 (SNYDER; KIRKLAND;
GLAJCH, 1997).

As amostras provenientes da degradação com HCl 1 M a 50 ºC durante 24 horas,

NaOH 0,01 M à temperatura ambiente durante 6 horas e H2O2 3% (v/v) à
temperatura ambiente durante 10 horas, foram injetadas também, utilizando
diferentes comprimentos de onda de detecção, sendo eles: 220, 254, 270 e 350 nm,
com o objetivo de verificar a existência de possíveis picos que não absorvam em
285 nm (comprimento de onda de detecção padronizado no método desenvolvido).
Caso outros picos fossem detectados, seria verificado se os mesmos se
encontravam bem resolvidos dos analitos de interesse.
 49

Para a comprovação da seletividade do método analítico frente aos excipientes da

formulação, preparou-se uma solução a partir dos placebos utilizados na fabricação
dos comprimidos de Viagra® e Cialis® (Tabela 3, página 38), com a finalidade de se
comprovar, visualmente, a ausência de picos interferentes nos tempos de retenção
do SLD e da TAD.

Realizou-se também, uma avaliação estatística para verificar se há diferença na

recuperação dos IFA em soluções contendo apenas os fármacos e soluções
contendo os fármacos e os placebos. Para isso, prepararam-se três soluções com
apenas os fármacos e três soluções contendo fármacos+placebos e comparou-se
estatisticamente a recuperação de SLD e TAD obtidas a partir dessas soluções
utilizando-se o teste F da análise de variância (ANOVA), com a finalidade de se
verificar possível interferência dos excipientes na resposta.

5.7.3 Linearidade

A linearidade foi avaliada construindo-se curva analítica para SLD e TAD em nove
níveis de concentração, na faixa de 20% a 180% das concentrações de trabalho (70
µg/mL para citrato de SLD e 20 µg/mL para TAD).

Para a construção da curva analítica, primeiramente, preparou-se solução padrão

estoque contendo 700 µg/mL de citrato de SLD e 200 µg/mL de TAD em Diluente 1.
Em seguida, a partir da solução padrão estoque, prepararam-se as replicatas das
soluções descritas na Tabela 9, utilizando o Diluente 2 para completar o volume.

As diluições foram realizadas em triplicata, totalizando 27 soluções. O preparo e a

injeção das soluções no sistema UHPLC-UV foram realizados em ordem aleatória
para evitar que variações temporais das condições cromatográficas interferissem no
resultado e para garantir a independência dos resultados.
 50

Tabela 9 – Preparo das soluções contendo SLD e TAD SQR para avaliação da linearidade.
Concentração citrato de SLD
Nível de concentração* Concentração TAD (µg/mL)
(µg/mL)
20% 14 4
40% 28 8
60% 42 12
80% 56 16
100% 70 20
120% 84 24
140% 98 28
160% 112 32
180% 126 36
*
em relação à concentração de trabalho.

Os valores dispersos (outliers) foram identificados pelo teste de resíduo padronizado

de Jacknife (α = 0,05). O critério de aceitação utilizado foi que no máximo 22% dos
dados originais da curva analítica poderiam ser excluídos (SOUZA, 2007; SOUZA;
JUNQUEIRA, 2005).

Em seguida, testes estatísticos foram aplicados para verificar se os dados de

regressão linear atenderiam às premissas para o Método dos Mínimos Quadrados
Ordinários (MMQO), conforme descrito por Souza e Junqueira (2005). As premissas
relacionadas à análise de regressão foram avaliadas quanto à normalidade, pelo
teste de Ryan-Joiner, homocedasticidade, pelo teste de Levene modificado por
Brown e Forsythe e independência dos resíduos da regressão, pelo teste de Durbin-
Watson. Em seguida, averiguou-se a adequação dos dados ao modelo linear, ou
seja, verificou-se se a regressão é significativa e se o desvio da linearidade não é
significativo utilizando ANOVA (INMETRO, 2018; SOUZA, 2007; SOUZA;
JUNQUEIRA, 2005).

Por fim, construiu-se curva analítica com os valores de área sob os picos do SLD e
da TAD obtidas para cada nível de concentração, estabeleceram-se os coeficientes
de determinação (R2), de correlação (R), angular (b), linear (a) e o gráfico de
distribuição dos resíduos. Avaliou-se a significância do coeficiente angular utilizando
o teste F da ANOVA, para comprovar que é estatisticamente diferente de zero. E
também realizou-se o teste do intercepto (coeficiente linear) utilizando a estatística t
de Student para verificar se o mesmo é estatisticamente igual a zero, ou seja, se a
curva analítica passa pela origem. A regressão linear foi então calculada pelo
 51

MMQO e a linearidade foi avaliada por meio da estimativa de todos esses

parâmetros.

5.7.4 Precisão e exatidão

A precisão e a exatidão foram avaliadas pelo método do placebo fortificado,

adicionando-se quantidades conhecidas de SLD e TAD à mistura dos componentes
das formulações (Tabela 3, página 38) com o intuito de determinar a porcentagem
de recuperação e os DPR entre as recuperações das soluções amostra preparadas.
O experimento foi realizado em três níveis de concentração: 20% (baixo), 100%
(médio) e 180% (alto) das concentrações de trabalho (70 µg/mL e 20 µg/mL de
citrato de SLD e TAD respectivamente). Para cada nível de concentração foram
preparadas três réplicas independentes e o experimento foi realizado em dois dias
distintos, por analistas diferentes.

Para que o método seja considerado exato, os valores para a recuperação média
em cada nível de concentração devem estar entre 98,0% e 102,0% (INMETRO,
2018). Para determinar a repetibilidade (precisão intradia), foi calculada a média de
recuperação e os DPR em cada nível. A precisão intermediária (interdias) foi
avaliada pela repetição do mesmo procedimento em outro dia, por outro analista, e
foi avaliada determinando-se o DPR em cada nível, considerando os dois dias de
análise. Recomenda-se que os valores de DPR sejam inferiores a 2% (GREEN,
1996).

5.7.5 Robustez

A robustez foi avaliada pelo método estatístico de Youden e Steiner (YOUDEN;

STEINER, 1975), no qual algumas condições cromatográficas foram variadas e a
influência das modificações nos resultados de recuperação do SLD e da TAD foi
avaliada. Em cada condição modificada foram realizadas injeções da solução padrão
a 100% das concentrações de trabalho dos fármacos e da solução amostra
contendo placebo, 70 µg/mL de citrato de SLD IFA e 20 µg/mL de TAD IFA. Os
parâmetros, bem como as variações avaliadas, encontram-se descritas na Tabela
10.
 52

Tabela 10 – Parâmetros e variações avaliados no teste de robustez.

Condição
Parâmetro Variação (-) Variação (+)
nominal
Temperatura da coluna a 32 ºC 35°C A 38 °C
Vazão da fase móvel b 0,25 mL/min 0,30 mL/min B 0,35 mL/min
Volume de injeção c 4,5 µL 5 µL C 5,5 µL
Fornecedor da acetonitrila d Honeywell Merck D J.T. Baker
pH do eluente aquoso e 2,8 3,0 E 3,2
Comprimento de onda de detecção f 280 nm 285 nm F 290 nm
Gradiente
Composição da fase móvel g Gradiente a1 G Gradiente b2
definitivo
1Gradiente a = constituído pela redução de 2% na proporção do solvente aquoso em cada linha do

gradiente definitivo (Tabela 7, página 46).

2Gradiente b = constituído pelo aumento de 2% na proporção do solvente aquoso em cada linha do

gradiente definitivo (Tabela 7, página 46).

Após a realização dos experimentos, foram obtidos os valores de teor para SLD e
TAD e calculou-se o efeito de cada variável subtraindo-se a média dos resultados
obtidos nos quatro experimentos em que determinada variável foi utilizada em nível
alto, pela média dos resultados obtidos nos quatro experimentos em que a mesma
variável foi utilizada em nível baixo (YOUDEN; STEINER, 1975).

Em seguida, o efeito de cada variável foi analisado no software estatístico Action

Stat®, sendo utilizado o método de Lenth e o gráfico de Daniel para a identificação
dos parâmetros significativos. O método analítico é considerado robusto se não
houver diferenças estatisticamente significativas nas respostas (teores de SLD e
TAD na solução amostra) frente às alterações propostas (BRASIL, 2017).

5.7.6 Limites de detecção e quantificação

Os limites de detecção e quantificação teóricos para o SLD e a TAD foram

estimados com base nos desvios padrão das respostas e na inclinação das
respectivas curvas analíticas (BRASIL, 2017; ICH-Q2(R1), 2005).

Para confirmar os limites teóricos, injetaram-se soluções de SLD e TAD na mesma

concentração obtida a partir da equação e, em seguida, foram realizadas diluições e
as razões sinal/ruído foram calculadas pelo software Empower. O limite de detecção
é aquele no qual a razão sinal/ruído é maior ou igual a 2:1, e o limite de
quantificação é aquele no qual a razão sinal/ruído é de, no mínimo, 10:1 (BRASIL,
2017; ICH-Q2(R1), 2005).
 53

5.7.7 Testes de seletividade e recuperação para diferentes diluentes

Para comprovar que o método desenvolvido e validado para determinação do teor

de SLD e TAD em comprimidos pode também ser utilizado na quantificação da
cedência (teste de dissolução e perfil de dissolução), foi necessário avaliar se o
método analítico é seletivo e garante recuperação adequada mesmo quando são
utilizados diferentes diluentes, tais como ácido clorídrico 0,01 M e dodecil sulfato de
sódio/laurilsulfato de sódio 0,5% (p/v), que são os meios descritos no teste de
dissolução das monografias de citrato de SLD comprimidos e TAD comprimidos,
respectivamente (THE UNITED, 2019).

Dessa forma, para comprovar a seletividade, injetaram-se os diluentes ácido

clorídrico 0,01 M e dodecil sulfato de sódio/laurilsulfato de sódio 0,5% (p/v) para
verificar se há picos nos tempos de retenção do SLD e TAD, que poderiam coeluir
com os mesmos e prejudicar a seletividade do método analítico.

Para a verificação da adequada recuperação, independente do diluente utilizado,

prepararam-se, para cada um dos três níveis de concentração estudados (20%,
100% e 180% das concentrações de trabalho) as seguintes soluções: três soluções
contendo placebo, SLD e TAD utilizando-se como diluente mistura de acetonitrila e
água; três soluções com placebo e SLD IFA utilizando-se como diluente ácido
clorídrico 0,01 M e três soluções com placebo e TAD IFA preparadas com dodecil
sulfato de sódio/laurilsulfato de sódio 0,5% (p/v) como diluente.

As soluções amostra foram injetadas em sistema UHPLC-UV aplicando o método

analítico desenvolvido e validado (Tabelas 6 e 7, páginas 45 e 46) e verificou-se
pelo teste F da ANOVA se havia diferença estatística entre a média das áreas sob
os picos obtidos em cada um dos grupos, para os três níveis avaliados.

5.8 Elucidação das estruturas químicas dos produtos de degradação

Com o objetivo de se propor estruturas químicas e mecanismos químicos de

formação dos produtos de degradação majoritários, utilizou-se a cromatografia
líquida de ultra eficiência com detector de arranjo de diodos (DAD) acoplada à
 54

espectrometria de massas sequencial, com ionização por electrospray (IES) e

analisador do tipo quadrupolo-tempo-de-voo (UHPLC-Q-TOF-MS).

As amostras provenientes do estudo de degradação forçada foram injetadas no

sistema UHPLC-Q-TOF-MS utilizando-se fase móvel constituída por acetonitrila com
ácido fórmico 0,5% (v/v) e tampão formiato de amônio 10 mM pH 3,0 (ajustado com
ácido fórmico) a uma vazão de 0,3 mL/min. O gradiente, a coluna cromatográfica, a
temperatura e o volume de injeção foram os mesmos utilizados no método
desenvolvido por UHPLC-UV (Tabelas 6 e 7, páginas 45 e 46). A detecção UV foi
realizada na faixa de 190 a 400 nm e a ionização dos analitos foi obtida no modo
positivo (IES (+)). Os parâmetros espectrométricos e os respectivos valores
utilizados durante a análise foram: voltagens do spray, fragmentador, skimmer e
octapol de 3000, 175, 75 e 750 V, respectivamente. A temperatura do gás de
secagem foi de 300 ºC, vazão de 8 L/min e pressão de 35 psi.

Primeiramente, as amostras degradadas foram injetadas no modo de varredura

(MS1 full-scan) e assim foi possível determinar as razões massa/carga (m/z) dos
íons precursores dos produtos de degradação majoritariamente formados. Em
seguida, os íons precursores foram fragmentados na célula de colisão, por meio da
aplicação de uma energia de colisão de 15 eV para TAD e respectivos produtos de
degradação e de 35 eV para SLD e seus produtos de degradação. Sendo assim,
foram obtidos os espectros de fragmentação (MS2 full-scan), com a detecção dos
íons produto formados de razão m/z na faixa de 90-1000 Da. Dessa forma,
conhecendo-se as razões m/z mais abundantes de cada íon precursor e dos
respectivos íons produto, foi possível propor estruturas e rotas de formação para os
produtos de degradação mais relevantes.

5.9 Análise dos medicamentos originais e apreendidos

5.9.1 Recebimento e armazenamento das amostras

Os comprimidos provenientes de apreensões e disponibilizados pela PF e pela

PCMG totalizaram 10 tipos diferentes de amostras suspeitas de conter SLD ou TAD,
que foram codificadas como amostras apreendidas 1 a 10, de acordo com a ordem
 55

cronológica de recebimento. Além dos medicamentos apreendidos, foram adquiridos

em farmácias, quatro diferentes lotes de medicamentos contendo SLD e quatro lotes
contendo TAD.

Após o recebimento das amostras, as mesmas foram armazenadas em dessecador

sob proteção da luz e temperatura controlada de 25 ºC.

5.9.2 Caracterização física dos comprimidos originais e apreendidos

Ao receber as amostras apreendidas e originais, registraram-se, por meio de

fotografias, as embalagens secundária e primária (quando presentes) e os
comprimidos. Em seguida, procedeu-se à determinação dos aspectos físicos, sendo
registradas as características visuais de cada comprimido (cor, forma e presença ou
ausência de marcações). Utilizando-se paquímetro digital, também foram
determinadas as medidas dos comprimidos, tais como comprimentos (maior e
menor) e espessura. Por fim, os comprimidos foram pesados utilizando-se balança
analítica. Os valores médios das medições obtidas para os comprimidos de uma
mesma amostra foram comparados com as demais amostras.

5.9.3 Aplicação do método: avaliação da qualidade dos medicamentos

originais e apreendidos

Com o objetivo de aplicar o método desenvolvido e validado (Tabelas 6 e 7, páginas

45 e 46), além de se determinar a qualidade dos comprimidos apreendidos e
originais, os mesmos foram submetidos aos principais testes de controle de
qualidade físico-químico, sendo eles: identificação, doseamento, uniformidade de
conteúdo, teste de dissolução e perfil de dissolução.

Durante a realização desses testes, não foi possível utilizar a quantidade de

unidades recomendadas nos métodos farmacopeicos, devido à limitação do número
de comprimidos disponíveis. Dessa forma, o número de comprimidos utilizados em
cada um dos testes de controle de qualidade foi estabelecido de acordo com o
número total de unidades obtido de cada amostra.
 56

No caso em que a quantidade total de comprimidos disponíveis era insuficiente para

a realização de todos os testes, priorizou-se a realização do doseamento, seguido
do teste de dissolução e perfil de dissolução. Na Tabela 11 encontram-se descritos
o número de unidades submetidas a cada teste de qualidade.

Tabela 11 – Número de comprimidos utilizados nos testes de controle de qualidade.

Quantidade Número de comprimidos utilizados no teste
total de Identificação Teste de
Amostra Uniformidade
comprimidos e dissolução e perfil
de conteúdo
disponíveis doseamento de dissolução
Apreendida 1 20 4 4 3
Apreendida 2 10 2 2 3
Apreendida 3 20 4 4 3
Apreendida 4 2 1 NR NR
Apreendida 5 5 1 NR 2
Apreendida 6 7 1 2 2
Apreendida 7 5 1 NR 2
Apreendida 8 6 1 NR 3
Apreendida 9 2 1 NR NR
Apreendida 10 20 4 4 3
Viagra 1 20 4 4 6
Viagra 2 15 4 3 6
Genérico SLD 1 20 4 4 6
Genérico SLD 2 20 4 4 6
Cialis 2 NR NR NR
Genérico TAD 1 10 2 3 3
Genérico TAD 2 10 2 3 3
Genérico TAD 3 10 2 3 3
Legenda: NR = Não realizado devido à indisponibilidade de amostra.

Para a quantificação dos analitos nas soluções amostra durante os testes de

qualidade, preparou-se curva analítica construída a partir de soluções padrão
contendo 20%, 100% e 180% das concentrações de trabalho (70 µg/mL para citrato
de SLD e 20 µg/mL para TAD).

Juntamente com o teste de doseamento, foi realizada a identificação do(s) IFA(s) em

cada uma das amostras.

Para o preparo das soluções amostra utilizadas no teste de doseamento,

primeiramente, pesaram-se os comprimidos e determinaram-se os pesos médios.
Em seguida estes foram pulverizados utilizando-se gral e pistilo. A partir de cada
pool de comprimidos, prepararam-se, no mínimo, duas soluções amostra. A
especificação para o doseamento de comprimidos contendo tanto SLD quanto TAD,
 57

de acordo com a Farmacopeia Americana (THE UNITED, 2019), é de, no mínimo

90,0% e, no máximo 110,0% do valor rotulado.

Durante a realização do teste de uniformidade de conteúdo, pesou-se um

comprimido e o transferiu para balão volumétrico de 100 mL. Prosseguiu-se o
preparo de acordo com o procedimento otimizado. O Valor de Aceitação (VA) foi
estimado conforme descrito na Farmacopeia Brasileira 6ª edição (FB 6), utilizando-
se valor de aceitabilidade (k) igual a 2,4 (correspondente à análise de 10 unidades),
uma vez que não se encontra descrito o k para número menor de unidades. O
produto cumpre o teste de uniformidade de doses unitárias se o VA não é maior que
15,0 (FARMACOPEIA, 2019).

Os parâmetros (meio de dissolução, aparato e tempo(s) de coleta) utilizados para o

teste de dissolução, foram os descritos nas respectivas monografias de citrato de
SLD e TAD comprimidos presentes na Farmacopeia Americana (THE UNITED,
2019). Ademais, o teste de perfil de dissolução foi realizado conforme preconizado
na Resolução RDC nº 31/2010 (ANVISA) (BRASIL, 2010).

Os comprimidos contendo SLD foram analisados utilizando-se 900 mL de ácido

clorídrico 0,01 M mantido a 37,0 ± 0,5 ºC como meio de dissolução e cestas a 100
rpm como aparato. Durante o teste de perfil de dissolução, coletaram-se 10 mL de
cada uma das cubas em sete diferentes tempos, sendo eles: 2, 5, 10, 15, 30, 45 e
60 minutos. As amostras coletadas foram imediatamente filtradas utilizando-se filtros
de seringa de 0,22 μm de tamanho de poro, transferidas para vial e injetadas no
sistema UHPLC-UV. Construiu-se a curva de cedência para os lotes analisados. Os
resultados obtidos no tempo de coleta de 15 minutos foram utilizados no teste de
dissolução. A porcentagem de cedência de cada unidade deveria ser maior ou igual
a 85% (Q = 80%) no primeiro estágio (E1) do teste de dissolução (THE UNITED,
2019).

Já para os comprimidos contendo TAD, foram utilizados 1000 mL de laurilsulfato de

sódio 0,5% (p/v) mantido a 37,0 ± 0,5 ºC como meio de dissolução e pás a 50 rpm
como aparato. Durante o teste de perfil de dissolução comparativo, coletaram-se 10
mL de cada uma das cubas após 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60 e 75 minutos do início do
 58

teste. As amostras coletadas foram imediatamente filtradas utilizando-se filtros de

seringa de 0,22 μm de tamanho de poro, transferidas para vial e injetadas em
cromatógrafo a líquido de ultra eficiência. Construiu-se a curva de cedência para os
lotes analisados. Os resultados obtidos nos tempos de coleta de 10 e 30 minutos
foram utilizados para o teste de dissolução. O critério de aceitação estabelecido para
o E1 é que a porcentagem de cedência de cada unidade deveria ser maior ou igual a
45% (Q = 40%) após 10 minutos e maior ou igual a 85% (Q = 80%) após 30 minutos
do início do teste (THE UNITED, 2019).
 59

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO

6.1 Solubilidade dos IFA SLD e TAD

Os termos descritivos da FB 6 (FARMACOPEIA, 2019) foram utilizados para

expressar a solubilidade dos IFA.

Após a realização do teste, o SLD foi classificado como pouco solúvel em água,
álcool etílico absoluto, metanol e ácido fórmico 0,1% (v/v); muito pouco solúvel em
acetonitrila e solúvel em mistura de acetonitrila e água 70:30 (v/v), que corresponde
ao diluente utilizado no método analítico desenvolvido (Diluente 1). A TAD, por sua
vez, foi classificada como praticamente insolúvel em água e em ácido fórmico 0,1%
(v/v); e pouco solúvel em álcool etílico absoluto, acetonitrila, metanol e no Diluente 1.
Portanto, considerou-se adequada a utilização de mistura de acetonitrila e água
70:30 (v/v) como diluente para o preparo das soluções amostra.

6.2 Identificação por espectrofotometria no infravermelho

Os espectros obtidos para o SLD SQR e IFA foram comparados para confirmar a
identidade da amostra (Figura 3). O fator de comparação obtido foi de 98,26%, valor
superior ao mínimo estabelecido no software Spectrum (>95,00%) para confirmação
de identidade. A sobreposição dos dois espectros demonstra que se trata da mesma
substância, uma vez que possuem bandas de absorção nos mesmos comprimentos
de onda e com as mesmas intensidades relativas.

As principais bandas de absorção obtidas nos espectros de infravermelho para o

SLD SQR e IFA, bem como as atribuições relativas aos grupos funcionais da
molécula, são apresentadas na Tabela 12.

Tabela 12 – Números de onda e atribuições das bandas de absorção obtidas nos espectros de
infravermelho do SLD IFA e SQR.
Número de onda Atribuição e grupo funcional
1171 cm-1 Deformação axial (simétrica) da ligação oxigênio=enxofre=oxigênio da sulfona
1357 cm-1 Deformação axial (assimétrica) da ligação oxigênio=enxofre=oxigênio da sulfona
1579 cm-1 Deformação axial da ligação dupla carbono-carbono de compostos aromáticos
1698 cm-1 Deformação axial da ligação dupla carbono-oxigênio de amida e/ou de ácido
carboxílico do citrato
3291 cm-1 Deformação axial da ligação nitrogênio-hidrogênio de amida secundária
 60

Figura 3 – Espectros de absorção na região do infravermelho do SLD SQR (preto) e IFA (azul).

Os espectros obtidos para a TAD SQR e IFA também foram comparados para
confirmar a identidade da amostra (Figura 4). O fator de comparação obtido foi de
97,46%, demonstrando que o IFA e a SQR são a mesma substância, uma vez que
possuem bandas de absorção nos mesmos comprimentos de onda e com
intensidades semelhantes. As atribuições das bandas de absorção relativas aos
grupos funcionais da molécula são apresentadas na Tabela 13.

Figura 4 – Espectros de absorção na região do infravermelho da TAD SQR (preto) e IFA (azul).

Tabela 13 – Números de onda e atribuições das bandas de absorção obtidas nos espectros de
infravermelho da TAD IFA e SQR.
Número de onda Atribuição e grupo funcional
1489 cm-1 Deformação axial da ligação dupla carbono-carbono de compostos aromáticos
1674 cm-1 Deformação axial da ligação carbono-oxigênio de amida
3322 cm-1 Deformação axial da ligação nitrogênio-hidrogênio de amida secundária
 61

6.3 Determinação dos máximos de absorção na região do ultravioleta

Os espectros de absorção na região do ultravioleta obtidos na faixa de comprimento

de onda de 200 a 400 nm a partir de soluções contendo 8 µg/mL de citrato de SLD
SQR e 5 µg/mL de TAD SQR, preparadas em acetonitrila e água 50:50 (v/v), são
apresentados na Figura 5.

Figura 5 - Espectros de absorção na região do ultravioleta do SLD (A) e da TAD (B).

Como pode ser observado, os máximos de absorção ocorrem em 212 nm, 223 nm e
290 nm para o SLD e 220 nm e 285 nm para a TAD. Com o objetivo de garantir um
método mais seletivo e com maior detectabilidade, optou-se por definir o
comprimento de onda de detecção do método analítico a ser desenvolvido e
validado em 285 nm, uma vez que neste comprimento de onda uma menor
quantidade de possíveis interferentes absorvem e também, tanto a TAD quanto o
SLD apresentam uma boa capacidade de absorção.

6.4 Estudos de degradação forçada

Ao realizar os estudos de degradação forçada, verificou-se que tanto o SLD quanto

a TAD não sofrem degradação quando expostos a água ultrapura e a solução de
sulfato de cobre 0,05 M com aquecimento a 50 ºC durante 144 horas (6 dias). As
amostras provenientes da degradação térmica e da exposição fotolítica também não
apresentaram formação de produtos de degradação e/ou redução da área sob os
picos do SLD e da TAD.
 62

Em relação às amostras submetidas a meio oxidativo (H2O2 3% (v/v), mantido à

temperatura ambiente), ocorreu a formação de um produto proveniente da
degradação da TAD (PD4) e de um produto de degradação (PD5) oriundo da
degradação do SLD.

Em meio alcalino (NaOH 0,01 M à temperatura ambiente), a TAD degradou

formando um produto de degradação (PD6). Em meio ácido (HCl 1 M a 50 ºC)
ocorreu a formação de um produto de degradação com o mesmo tempo de retenção
do produto formado em meio alcalino (PD6), além da formação de três outros
produtos de degradação de menor intensidade (PD1, PD2 e PD3) provenientes da
degradação da TAD. O SLD não apresentou degradação nas condições ácida e
alcalina, mesmo após 144 horas (6 dias) de exposição.

TAD e SLD são suscetíveis à degradação em algumas condições, as quais devem

ser consideradas no desenvolvimento da formulação e na determinação das
condições de embalagem e armazenamento do medicamento. A investigação do
perfil de degradação do fármaco pode indicar tipos de adjuvantes, aditivos de
proteção específicos e de acondicionamento, que melhoram a integridade do IFA e
do produto acabado. Demonstra-se assim, que o conhecimento do comportamento
químico pode ser utilizado para garantir a estabilidade da forma farmacêutica
desejada (SILVA et al., 2009).

A TAD apresentou-se susceptível à degradação em meios ácido e alcalino. Diante

deste resultado, deve-se privar ao máximo o contato deste IFA com a umidade
durante a fabricação e armazenamento do medicamento. Recomenda-se evitar o
método de granulação por via úmida durante a sua fabricação e deve ser priorizada
a utilização de embalagens impermeáveis, com o objetivo de evitar, ou ao menos,
reduzir a sua degradação.

O SLD e a TAD apresentaram-se susceptíveis à degradação em meio oxidativo com

peróxido de hidrogênio. A estabilização de fármacos frente a condições oxidativas
envolve precauções durante a fabricação e estocagem. Uma vez que o oxigênio é o
principal responsável pela reação de oxidação, uma maneira de evitar a degradação
é o preenchimento total dos recipientes, ou a substituição de oxigênio por outro gás
 63

como o nitrogênio ou dióxido de carbono. Como alternativa mais simples, tem-se a

utilização de adjuvantes farmacotécnicos como antioxidantes, que podem sofrer
degradação preferencial em relação ao IFA ou agir como inibidores de cadeias de
radicais livres, e assim haverá redução da degradação do IFA (BAERTSCHI;
ALSANTE; REED, 2011; FLORENCE; ATTWOOD, 2011).

6.5 Desenvolvimento do método para quantificação simultânea de SLD, TAD e

potenciais produtos de degradação por UHPLC-UV

A utilização de métodos indicativos de estabilidade é recomendada pelas agências

regulatórias para a quantificação de fármacos. No caso de análises de
medicamentos ilegais, seu uso é ainda mais importante, uma vez que, como não são
conhecidos os procedimentos de fabricação, embalagem e armazenamento desses
produtos, os mesmos podem conter impurezas diversas.

O desenvolvimento do método para quantificação de SLD e TAD utilizando UHPLC-

UV e coluna com partículas superficialmente porosas foi realizado para ser utilizado
nos testes de identificação, doseamento, uniformidade de conteúdo, dissolução e
perfil de dissolução de comprimidos autênticos e apreendidos pelas autoridades
policiais.

Ademais, com o objetivo de se obter um método seletivo aos IFA e aos possíveis
produtos de degradação/impurezas que podem estar presentes tanto nos
comprimidos originais, quanto nos falsificados ou contrabandeados, os IFA foram
expostos a condições de degradação forçada e as amostras degradadas foram
utilizadas na otimização do método.

Optou-se por desenvolver um único método para quantificação simultânea desses

IFA, uma vez que os medicamentos contendo esses fármacos são os mais
falsificados no Brasil e, assim, o método pode ser aplicado para medicamentos
contendo tanto SLD quanto TAD e, também pelo fato de encontrarem-se descritos
na literatura, casos em que os produtos ilegais alegavam conter SLD na embalagem,
mas tinham TAD ou uma mistura desses ingredientes ativos e produtos que
continham grandes quantidades de contaminantes (COELHO, LISBOA, 2017; ORTIZ
 64

et al., 2011; ORTIZ et al., 2012a; ORTIZ et al., 2012b; ORTIZ et al., 2013; VEJI et al.,
2008; VENHUIS et al., 2010).

Iniciou-se o desenvolvimento do método por UHPLC-UV por meio da realização dos

gradientes exploratórios. Com esses resultados foi possível verificar o número de
analitos que seria necessário separar e conhecer as características da amostra.

Ao analisar o diagrama de ionização do SLD ao longo da faixa de pH (Figura 6A),

verifica-se que, em baixos valores de pH, o SLD encontra-se majoritariamente na
sua forma ionizada (protonada). Como para a TAD, independente do pH do meio, o
mesmo apresenta-se na forma neutra (Figura 6B), optou-se por utilizar um eluente
aquoso ácido, uma vez que em meio ácido o SLD se encontrará predominantemente
em uma única forma (forma ionizada) e assim apresentará uma interação mais
uniforme com a fase estacionária, o que favorecerá a obtenção de um pico
cromatográfico mais simétrico, fino e com altura maior.

Figura 6 – Diagrama de distribuição das formas ao longo da faixa de pH: SLD (A) e TAD (B).

(A) (B)
Fonte: adaptado de CHEMAXON, 2018.

Em relação aos testes utilizando eluição isocrática, nenhuma condição avaliada

proporcionou resolução adequada entre todos os picos, sendo que algumas
provocaram baixa intensidade dos picos, fator de cauda elevado para o SLD e longo
tempo de corrida. Apesar de não ter sido possível obter um método isocrático capaz
 65

de separar adequadamente os analitos de interesse, nessa etapa do

desenvolvimento foi possível definir os eluentes orgânico e aquoso, uma vez que a
mistura de acetonitrila e TEA 0,2% (v/v) pH 3,0 foi a que proporcionou maior
intensidade dos picos e menor fator de cauda para o pico do SLD.

O uso de TEA como aditivo no eluente aquoso, foi capaz de minimizar a formação
de cauda pronunciada no pico do SLD. O SLD é um analito que apresenta caráter
básico e, por isso, pode interagir com os grupos silanóis residuais presentes na
coluna cromatográfica que apresentam caráter predominantemente ácido
(interações secundárias), resultando em interações diferenciadas ao longo da coluna
e consequente formação de cauda no pico cromatográfico. A utilização de TEA faz
com que esta molécula interaja preferencialmente com os grupos silanóis residuais e
então, o SLD irá interagir majoritariamente com as cadeias carbônicas da fase
ligada, apresentando um tipo de interação predominante e resultando em um pico
cromatográfico com menor fator de cauda, mais agudo e intenso (BORGES;
GORAIEB; COLLINS, 2012; SNYDER; KIRKLAND; GLAJCH, 1997).

Dando prosseguimento ao desenvolvimento do método analítico, para a adequada

separação entre os picos dos produtos de degradação gerados nos testes de
estresse e os picos do SLD e da TAD, iniciaram-se os testes com diferentes eluições
em gradiente, alterando-se o tempo e a proporção dos eluentes.

Após todos esses testes, as condições cromatográficas e o gradiente do método que

promoveram os melhores resultados para os parâmetros de adequabilidade do
sistema foram os apresentados nas Tabelas 6 e 7 (páginas 45 e 46). Os
cromatogramas obtidos a partir das amostras degradadas são apresentados na
Figura 7.

Os parâmetros cromatográficos tempo morto (t0), fator de retenção (k), número de

pratos teóricos (N), resolução (R) e fator de cauda (Tf) obtidos com o método
otimizado foram calculados para as soluções padrão contendo 70 µg/mL de citrato
de SLD e 20 µg/mL de TAD e para as soluções amostra provenientes da
degradação em meio ácido, alcalino e oxidativo (Tabela 14). O tempo morto obtido
com injeção de solução de uracila a 50 µg/mL foi de 0,38 minuto.
 66

Figura 7 – Cromatogramas obtidos a partir do método otimizado e das amostras submetidas a

testes de degradação forçada: em azul cromatograma proveniente da degradação em meio
alcalino (NaOH 0,01 M mantido à temperatura ambiente durante 24h); em vermelho
cromatograma proveniente da degradação em meio ácido (HCl 1 M mantido a 50 ºC durante
24h); em preto cromatograma proveniente da degradação em meio oxidativo (H2O2 3% (v/v)
mantido à temperatura ambiente durante 24h).

Legenda: SLD = sildenafila; TAD = tadalafila; TA = temperatura ambiente; PD1, PD2 e PD3= produtos
de degradação formados em meio ácido, provenientes da degradação da TAD; PD4= produto de
degradação proveniente da degradação da TAD em meio oxidativo; PD5= produto de degradação
formado em meio oxidativo, proveniente da degradação do SLD; PD6= produto de degradação
formado em meio ácido e alcalino, proveniente da degradação da TAD.

Tabela 14 – Parâmetros de adequabilidade do sistema obtidos com a solução padrão e

amostras degradadas durante 24 horas e utilizando-se o método desenvolvido e otimizado
apresentado nas Tabelas 6 e 7 (páginas 45 e 46).
Tempo de Fator de Número de
Resolução Fator de
Condição Analito retenção (tR) retenção pratos
(R) cauda (Tf)
(min) (k) teóricos (N)
Solução SLD 3,47 8,13 - 1,85 13229
padrão TAD 5,53 13,55 18,69 0,85 35987

SLD 3,43 8,02 - 1,90 12048

NaOH 0,01
TAD 5,43 13,29 16,59 0,86 37363
M, 24h, TA
PD6 5,61 13,76 1,53 - 34331

PD1 1,99 4,24 - 14550

PD2 2,15 4,66 1,61 - 4242
HCl 1 M, PD3 2,32 5,10 1,36 - 40343
24h, 50 ºC SLD 3,43 8,03 14,00 1,95 13030
TAD 5,44 13,32 16,87 0,86 36759
PD6 5,62 13,79 1,52 - 33895

PD4 3,04 7,00 - - 47869

H2O2 3%, SLD 3,44 8,05 6,98 1,85 14989
24h, TA PD5 3,76 8,89 3,66 - 72872
TAD 5,43 13,29 19,31 0,88 36473
 67

Os parâmetros cromatográficos estão de acordo com as recomendações, ou seja, os

fatores de retenção (k) encontrados foram superiores a 2,0 e a resolução entre o par
crítico (TAD-PD6) foi maior que 1,5 (SNYDER; KIRKLAND; GLAJCH, 1997). O
número de pratos teóricos encontrado foi superior a 12000 para os picos do SLD e
da TAD e os fatores de cauda foram inferiores a 2,0 (DOLAN, 2003).

6.6 Resultados da otimização do preparo da amostra para os testes de

determinação de teor de SLD e TAD em comprimidos

Com o objetivo de se determinar as etapas que proporcionariam maiores valores de

recuperação tanto de SLD quanto de TAD nas amostras de comprimidos, durante os
testes de doseamento e uniformidade de conteúdo, realizou-se um planejamento
fatorial 24, conforme descrito no item 5.6 (página 46).

Após a realização dos 16 experimentos, nos quais foram avaliadas as variáveis

independentes composição do diluente (X1), tempo de extração no ultrassom (min)
(X2), procedimento para remoção de partículas (filtração/centrifugação) (X3) e
estabilidade das soluções (X4), os resultados de recuperação obtidos são
apresentados na Tabela 15.

Tabela 15 – Matriz experimental e respostas obtidas com o planejamento fatorial 24.

Recuperação Recuperação
Ensaio X1 X2 X3 X4
de SLD (%) de TAD (%)
- - - -
1 Diluentes 1 e 2 10 min Filtração Tempo zero 102,87 101,89
+ - - -
2 Diluentes 3 e 4 10 min Filtração Tempo zero 99,66 101,30
- + - -
3 Diluentes 1 e 2 20 min Filtração Tempo zero 105,16 101,78
+ + - -
4 Diluentes 3 e 4 20 min Filtração Tempo zero 99,69 100,63
- - + -
5 Diluentes 1 e 2 10 min Centrifugação Tempo zero 104,72 101,77
+ - + -
6 Diluentes 3 e 4 10 min Centrifugação Tempo zero 98,99 99,46
- + + -
7 Diluentes 1 e 2 20 min Centrifugação Tempo zero 103,31 101,42
+ + + -
8 Diluentes 3 e 4 20 min Centrifugação Tempo zero 99,58 100,26
- - - +
9 Diluentes 1 e 2 10 min Filtração 24 h 103,62 101,89
+ - - +
10 Diluentes 3 e 4 10 min Filtração 24 h 100,14 101,30
 68

Tabela 15 – Matriz experimental e respostas obtidas com o planejamento fatorial 24 (continuação).

Recuperação Recuperação
Ensaio X1 X2 X3 X4
de SLD (%) de TAD (%)
- + - +
11 Diluentes 1 e 2 20 min Filtração 24 h 105,40 101,78
+ + - +
12 Diluentes 3 e 4 20 min Filtração 24 h 99,93 100,63
- - + +
13 Diluentes 1 e 2 10 min Centrifugação 24 h 106,09 101,77
+ - + +
14 Diluentes 3 e 4 10 min Centrifugação 24 h 99,96 99,46
- + + +
15 Diluentes 1 e 2 20 min Centrifugação 24 h 104,04 101,42
+ + + +
16 Diluentes 3 e 4 20 min Centrifugação 24 h 100,28 100,26

Os efeitos principais e de segunda ordem foram calculados e o erro foi estimado

(0,4830 para SLD e 0,1923 para TAD). A significância dos efeitos principais foi
obtida, com 95% de confiança, utilizando-se o software Microsoft Excel® e o software
STATISTICA® e os valores obtidos encontram-se na Tabela 16.

Tabela 16 – Efeitos principais, valores inferiores e superiores do intervalo de confiança de

cada efeito e interpretação da significância de cada efeito para na recuperação de SLD e TAD.
SLD TAD
Variável Intervalo de Intervalo de
Efeito confiança Interpretação Efeito confiança Interpretação
(-) (+) (-) (+)
1 -4,62 -5,86 -3,38 Significativo -1,30 -1,80 -0,81 Significativo
Não Não
2 0,17 -1,08 1,41 -0,08 -0,58 0,41
significativo significativo
Não
3 0,06 -1,18 1,31 -0,67 -1,17 -0,18 Significativo
significativo
Não Não
4 0,68 -0,56 1,93 0,00 -0,49 0,49
significativo significativo

Na Figura 8 são apresentados os diagramas de Pareto referentes à recuperação de

SLD e TAD. Os efeitos de segunda ordem não se mostraram significativos na
recuperação de ambos os analitos e, por isso, os resultados referentes às interações
dos fatores não foram apresentados.

Ao analisar a Tabela 16 e a Figura 8, conclui-se que, tanto para a recuperação do

SLD quanto para a TAD, a composição do diluente (variável 1) é significativa, de
forma que, a recuperação é reduzida em 4,62% para o SLD e em 1,20% para a
TAD, quando altera-se os Diluentes 1 e 2 (nível inferior) para os Diluentes 3 e 4
(nível superior). Portanto, para maximizar a recuperação, no preparo de amostra
devem ser utilizados os Diluentes 1 e 2, constituídos por acetonitrila e água. Em
 69

relação à variável 2, tempo de ultrassom, a mesma não se apresentou significativa

para a recuperação dos analitos. Com o objetivo de reduzir o tempo do preparo da
amostra, optou-se por padronizar a utilização do nível inferior dessa variável, ou
seja, as amostras devem permanecer durante 10 minutos em banho de ultrassom.
Os resultados obtidos para a variável 3 (procedimento para remoção de partículas),
mostraram que a recuperação do SLD independe de utilizar a filtração ou
centrifugação, mas para a TAD, a recuperação reduz em 0,67% quando utiliza-se a
centrifugação. Sendo assim, optou-se por padronizar a filtração utilizando-se filtros
de seringa de 0,45 µm de tamanho de poro, para remoção das partículas da solução
amostra. Por fim, a estabilidade das soluções amostra para ambos analitos foi
considerada adequada durante 24 horas, uma vez que o efeito (variável 4) não foi
estatisticamente significativo.

Figura 8 – Diagramas de Pareto referente às recuperações de SLD (A) e de TAD (B) obtidas no
planejamento fatorial 24.

Como os resultados da otimização do preparo de amostra mostraram que deve ser

utilizada a filtração para remoção das partículas, testou-se a influência da filtração
na recuperação do SLD e da TAD, comparando-se estatisticamente, por ANOVA, a
média da área sob o pico dos analitos obtidas a partir de três soluções amostra dos
IFA que passaram pelo processo de filtração, com três soluções amostra dos IFA
que não foram filtradas. Com os resultados obtidos, pôde-se confirmar que a
filtração não influencia a recuperação dos analitos (Fcalculado é inferior ao Ftabelado) e,
portanto, a filtração pode ser utilizada durante o preparo de amostra.
 70

6.7 Validação do método analítico

6.7.1 Adequabilidade do sistema

Os resultados de adequabilidade do sistema foram satisfatórios. O DPR das áreas

sob os picos de SLD e TAD e dos tempos de retenção foram inferiores a 1%, o fator
de cauda médio foi de 1,85 para o SLD e 0,85 para a TAD e o fator de retenção (k)
foi maior que 2 tanto para o SLD quanto para a TAD (DOLAN, 2003; SNYDER;
KIRKLAND; GLAJCH, 1997; UNITED STATES, 1994).

6.7.2 Seletividade

Na Figura 9 observam-se os cromatogramas obtidos a partir do estudo de

degradação com os IFA isolados e juntos. Como pode ser verificado, a TAD foi
susceptível à degradação em meios ácido, alcalino e oxidativo. O SLD, por sua vez,
sofreu degradação apenas na presença de peróxido de hidrogênio.

Figura 9 – Cromatogramas provenientes da degradação de mistura dos IFA SLD e TAD

(vermelho) e da degradação dos IFA isolados SLD (azul) e TAD (preto) com: HCl 1 M mantido a
50ºC durante 24 horas (A), NaOH 0,01 M mantido à temperatura ambiente durante 24 horas (B)
e H2O2 3% (v/v) mantido à temperatura ambiente durante 24 horas (C).
 71

Uma vez que o detector ultravioleta utilizado para o desenvolvimento e validação do

método por UHPLC é do tipo variável, não foi possível realizar o teste de pureza de
pico, o qual é exigido na RDC nº 166 de 2017 (ANVISA) (BRASIL, 2017). Dessa
forma, na tentativa de evidenciar a presença de coeluições, soluções padrão e
amostras degradadas foram injetadas e analisadas em diferentes comprimentos de
onda de detecção ao longo da faixa ultravioleta e os cromatogramas obtidos foram
comparados.

Entretanto, independente do comprimento de onda de detecção utilizado, os picos

apresentaram sempre o mesmo formato, sendo observado apenas alteração na
intensidade. Além disso, durante as análises para a identificação dos produtos de
degradação, usando o modo de varredura (MS1 full-scan), nenhum pico adicional foi
observado. Ademais, não foram visualizados picos provenientes dos excipientes e
do diluente eluindo no mesmo tempo de retenção do analitos de interesse.

Para comprovar a ausência de interferência do placebo no comprimento de onda de

285 nm, procedeu-se à análise estatística da seletividade pelo teste F da ANOVA e,
os resultados de recuperação obtidos para as soluções contendo apenas os
fármacos e soluções contendo fármacos + placebo (Tabela 17) mostram que o
placebo não interfere na quantificação de SLD e TAD em 285 nm, ou seja, o método
é seletivo frente aos excipientes das formulações, uma vez que não há diferença
estatística entre as médias dos dois grupos comparados (soluções contendo apenas
os fármacos e soluções contendo fármacos + placebo).

Tabela 17 - Resultados obtidos no teste de seletividade com as soluções contendo apenas os

fármacos e soluções contendo fármacos + placebo.
SLD TAD
Recuperação (%) Recuperação (%)
Amostra Soluções Soluções
Soluções Fcalculado Ftabelado Soluções Fcalculado Ftabelado
fármacos + fármacos +
fármaco fármaco
placebo placebo
1 100,42 102,23 100,75 99,32
2 101,66 101,30 100,69 99,20
3 100,89 102,26 3,8542 7,7086 99,52 100,79 0,7249 7,7086
Média 100,99 101,93 100,32 99,77
DPR (%) 0,6193 0,5360 0,6925 0,8912
 72

6.7.3 Linearidade

Avaliou-se a linearidade do método construindo-se curva analítica para o SLD e a

TAD em nove níveis de concentração, na faixa de 20% a 180% das concentrações
de trabalho. Optou-se por validar o método em uma faixa ampla de concentração,
uma vez que será utilizado para a análise de controle de qualidade de
medicamentos suspeitos de falsificação e/ou contrabando e, dessa forma, as
amostras podem apresentar diferentes níveis de concentração do analito.

Após a aplicação dos testes estatísticos, detectaram-se quatro outliers para o

conjunto de dados do SLD e cinco para a TAD, os quais foram excluídos. Os
resíduos provenientes das curvas analíticas atenderam a todas as premissas
necessárias para utilização do MMQO, conforme mostrado na Tabela 18.

Tabela 18 – Avaliação das premissas necessárias à utilização do MMQO para o conjunto de

dados do SLD e da TAD.
Resultados obtidos
Premissas (testes) Especificações Conclusões
SLD TAD
Quatro pontos Cinco pontos
Teste de outliers │Jei│>Jcrítico Exclusão dos pontos
apresentaram apresentaram
(Jacknife) para α=0,05 considerados outlier
Jei>Jcrítico Jei>Jcrítico
Normalidade Req≥Rcrítico Req=0,9829 Req=0,9743 Os resíduos seguem
(Ryan-Jones) para α=0,05 Rcrítico=0,9554 Rcrítico=0,9538 a distribuição normal
Não há correlação
Independência dos du=1,4375 du=1,4288
du<dcalculado<4-du entre os resíduos
resíduos dcal=1,5429 dcal=1,5851
para α=0,05 (os resíduos são
(Durbin-Watson) 4-du=2,5625 4-du=2,5712
independentes)
Homocedasticidade Há
tL≤tcrítico tL=0,4245 tL=0,9725
(Brown-Forsythe ou homocedasticidade
para α=0,05 tcrítico =2,0796 tcrítico=2,0860
Levene modificado) entre os resíduos
Fonte: tabela construída com base nas informações disponíveis em SOUZA, 2007 e SOUZA;
JUNQUEIRA, 2005.

Diante dos resultados satisfatórios em relação às premissas, aplicou-se o MMQO e,

assim, foi possível obter as curvas analíticas, as equações das retas e os
coeficientes de determinação (R2) para SLD e TAD, os quais são apresentados na
Figura 10.
 73

Figura 10 – Curvas analíticas para avaliação da linearidade do método para o citrato de SLD (A)
e para a TAD (B).

Os gráficos de distribuição de resíduos são apresentados na Figura 11. Ao analisá-

los, é possível verificar uma distribuição aleatória dos pontos e, portanto, ausência
de qualquer tendência.

Figura 11 – Gráficos de distribuição de resíduos para o conjunto de dados do SLD (A) e da

TAD (B).

A avaliação da significância do coeficiente angular das equações das retas obtidas,

para o SLD e para a TAD, demonstrou que o p-valor do teste F da ANOVA é menor
que 0,05. Portanto, rejeitou-se a hipótese nula (coeficiente angular igual a zero) ao
nível de significância de 5% e conclui-se que o coeficiente angular é
significativamente diferente de zero, conforme preconizado na RDC nº 166/2017
(ANVISA) (BRASIL, 2017).

Em relação à avaliação estatística do coeficiente linear da equação da reta obtida

para o SLD, utilizando-se o teste t de Student, foi obtido um p-valor de 0,0317, que é
menor que 0,05. Dessa forma, rejeitou-se a hipótese nula (intercepto igual a zero) ao
 74

nível de significância de 5%. Já ao avaliar os dados obtidos para a TAD foi

encontrado um p-valor de 0,7509, ou seja, o coeficiente linear não é
significativamente diferente de zero e, nesse caso, a curva analítica passa pela
origem.

Quando é encontrado intercepto (coeficiente linear) estatisticamente diferente de

zero e com magnitude significativa frente às respostas analíticas, como foi o caso do
SLD, é recomendado a utilização de uma curva de calibração, ao invés de um ponto
único, para a quantificação das amostras na rotina de análise (PORTAL ACTION,
2020b). Dessa forma, uma vez que, a reta obtida para o SLD não passa pela origem,
seguiu-se a recomendação, e então a quantificação dos analitos nas amostras foram
realizadas utilizando-se sempre uma curva de calibração construída a partir de
soluções padrão a 20%, 100% e 180% das concentrações de trabalho (70 µg/mL
para citrato de SLD e 20 µg/mL para TAD).

Os coeficientes de correlação (R) obtidos para ambas as curvas foi de 0,9999 e está
de acordo com o preconizado na Resolução RDC nº 166/2017 (ANVISA), na qual é
descrito que o critério mínimo aceitável para um método ser considerado linear, é
que a curva analítica apresente um R maior ou igual a 0,990 (BRASIL, 2017).
Entretanto, de acordo com Thompson, Ellison e Wood (2002), o R é inadequado
para indicar a falta de ajuste ao modelo linear, não devendo ser utilizado como teste
de linearidade (THOMPSON; ELLISON; WOOD, 2002). R e R2 indicam o grau de
ajuste dos dados à curva, independente do modelo. Contudo, valores de R próximos
a 1, não pertencem necessariamente a uma relação linear, podendo resultar de
pontos bem ajustados a um modelo não linear (RSC, 2005; SOUZA, 2007).

Diante disso, realizou-se a análise da variância (ANOVA) para determinar a

significância da regressão e do desvio de linearidade. Com os resultados obtidos,
conclui-se que a regressão é estatisticamente significativa (p < 0,05) e que não há
desvio de linearidade (p > 0,05) tanto para o conjunto de dados referentes ao SLD
quanto à TAD, ou seja, o método demonstrou ser linear na faixa de 14-126 µg/mL
para o citrato de SLD e 4-36 µg/mL para a TAD.
 75

6.7.4 Precisão e exatidão

Os resultados das porcentagens de recuperação de SLD e TAD obtidos para os

níveis avaliados (20%, 100% e 180% das concentrações de trabalho) em dois dias
de análise, e os respectivos valores de DPR obtidos, estão apresentados na Tabela
19.

Tabela 19 - Porcentagens de recuperação de SLD e TAD e DPR obtidos para a avaliação da

exatidão e precisão do método analítico.
SLD TAD
Nível* Recuperação Recuperação
DPR (%) DPR (%)
média (%) média (%)
20% 101,34 0,0725 99,99 0,4544
Dia 1
100% 99,59 1,8490 100,05 0,2439
(intradia)
180% 100,65 0,3716 100,21 0,4014

20% 99,60 1,6344 101,82 0,1088

Dia 2
100% 101,72 0,5306 101,62 0,4227
(intradia)
180% 98,89 1,8102 101,17 0,1532

20% 100,47 1,3955 100,90 1,1279

Interdias 100% 100,66 1,6733 100,83 0,9070
180% 99,77 1,5098 100,69 0,5894
*Em relação às concentrações de trabalho.

Os valores de recuperação média, nos dois dias de análise, encontraram-se entre

98% e 102%, indicando que o método apresentou exatidão adequada (INMETRO,
2018). Os DPR encontrados para cada nível, em cada dia de análise (repetibilidade)
e, considerando-se os dois dias de análise (precisão intermediária), estão de acordo
com Green (1996), visto que tais valores são inferiores a 2,0%. Deste modo, conclui-
se que o método apresenta precisão satisfatória.

6.7.5 Robustez

Após a realização dos testes de robustez, obtiveram-se os valores de teor para SLD
e TAD em cada um dos experimentos realizados e o efeito de cada variável foi
calculado (Tabela 20).
 76

Tabela 20 – Avaliação do efeito das variáveis na determinação de SLD e TAD por UHPLC.
pH
Volume Fornecedor ʎ Composição Teor Teor
Temperatura Vazão eluente
injeção ACN detecção fase móvel SLD TAD
(A/a) (B/b) aquoso
(C/c) (D/d) (F/f) (G/g) (%) (%)
(E/e)
A B C D E F G 99,88 100,40
A B c D e f g 100,51 100,96
A b C d E f g 100,22 100,49
A b c d e F G 100,02 100,57
a B C d e F g 99,86 100,25
a B c d E f G 100,21 100,50
a b C D e f G 100,16 100,64
a b c D E F g 100,23 100,55
Efeito
0,04 -0,04 -0,21 0,12 0,00 -0,28 -0,14 - -
SLD
Efeito
0,12 -0,03 -0,20 0,19 -0,12 -0,20 -0,03 - -
TAD

Os gráficos de Daniel e Lenth são apresentados nas Figuras 12 e 13 para o SLD e

a TAD, respectivamente. A análise desses gráficos é uma maneira objetiva para
definir quais efeitos são significativos na análise de experimentos sem réplicas.

O gráfico de Daniel trata-se de um gráfico de probabilidade half-normal dos efeitos,

no qual, os efeitos cujos pontos estiverem claramente afastados de uma linha de
ajuste de distribuição, formada pela nuvem de pontos, serão julgados ativos, ou seja,
efeitos estatisticamente significativos (DANIEL, 1959; PORTAL ACTION, 2020a).

No gráfico de Lenth é expressa uma margem de erro (ME). Variáveis que excedem o
valor de ME são consideradas significativas. No entanto, quando há muitas
variáveis, pode ocorrer de uma ou duas, mesmo que não significativas, exceder o
valor de ME, conduzindo a uma falsa conclusão. Por isso, é definida uma margem
de erro simultânea (SME). Constrói-se então um gráfico de barras mostrando os
valores absolutos dos efeitos estimados e adiciona-se as linhas de referências com
os valores de ME e SME. As variáveis cujas barras ultrapassam a linha SME são
consideradas significativas, enquanto aqueles cujas barras não extrapolam a linha
de referência ME são consideradas não significativas. A região entre as linhas ME e
SME é dita região de incerteza e, para variáveis cujas barras estão nesse intervalo,
é necessário analisar minunciosamente e fundamentar a decisão da variável ser
significativa ou não (LENTH, 1989; PORTAL ACTION, 2020a).
 77

Ao observar as Figuras 12 e 13, verifica-se que nos gráficos de Daniel não é

possível perceber deslocamento significativo de nenhum dos fatores em relação à
reta e, ao analisar o gráfico de Lenth, não são observados fatores que ultrapassam a
ME. Dessa forma, conclui-se que não foram detectados efeitos ativos, ou seja, o
método foi robusto para todas as variações testadas, tanto para a quantificação do
SLD quanto da TAD.

Figura 12 – Gráficos de Daniel (A) e de Lenth (B) obtidos para o teste de robustez para SLD.

Legenda: ME = margem de erro dos contrastes; SME = margem de erro simultânea.

Figura 13 – Gráficos de Daniel (A) e de Lenth (B) obtidos para o teste de robustez para TAD.

Legenda: ME = margem de erro dos contrastes; SME = margem de erro simultânea.

6.7.6 Limites de detecção e de quantificação

Os limites de detecção e quantificação teóricos, estimados pelas curvas analíticas,

proporcionaram uma relação sinal/ruído muito superiores a dois e dez,
 78

respectivamente. Então diluições foram realizadas para determinar os limites reais

do método analítico. Os limites de detecção e quantificação obtidos foram de 0,0014
e 0,0042 µg/mL, respectivamente, para citrato de SLD e 0,0022 e 0,0068 µg/mL,
respectivamente, para TAD.

6.7.7 Testes de seletividade e recuperação para diferentes diluentes

Os cromatogramas obtidos a partir da injeção de mistura de acetonitrila e água

(Diluente 1), ácido clorídrico 0,01 M e laurilsulfato de sódio 0,5% (p/v) apresentaram
o mesmo perfil e não apareceram picos provenientes desses diluentes eluindo nos
tempos de retenção do SLD e da TAD. Assim o método também é seletivo quando
se utiliza ácido clorídrico e laurilsulfato de sódio como diluentes das amostras.

Foram obtidas as áreas sob os picos de SLD e TAD em cada um dos níveis, para
soluções amostra preparadas com diluentes constituídos por mistura de acetonitrila
e água; ácido clorídrico 0,1 M e laurilsulfato de sódio 0,5% (p/v), bem como a
comparação estatística pelo teste F de ANOVA, apresentada na Tabela 21.

Tabela 21– Áreas sob os picos do SLD e da TAD e comparação estatística quando são
utilizados diferentes diluentes.
Área sob o pico do SLD (mAu.s) Área sob o pico da TAD (mAu.s)
Mistura de Ácido Mistura de Laurilsulfato
Nível*
acetonitrila clorídrico Fcalculado Ftabelado acetonitril de sódio Fcalculado Ftabelado
e água 0,01 M a e água 0,5% (p/v)
243904 244280 114905 117532
20% 241763 246198 121177 115177
248586 238910 0,2983 7,7086 115253 112417 0,6771 7,7086
Média 244751 243129 117112 115042
DPR (%) 1,4257 1,5538 3,0099 2,2254
1343636 1277288 617179 627348
100% 1313008 1209227 624517 624234
1292984 1307521 2,5333 7,7086 634843 615316 0,2631 7,7086
Média 1316543 1264679 625513 622299
DPR (%) 1,9377 3,9809 1,4187 1,0035
2298337 2367138 1125618 1109381
180% 2387607 2269926 1176820 1136965
2376562 2382483 0,1009 7,7086 1151060 1127539 2,4798 7,7086
Média 2354169 2339849 1151166 1124628
DPR (%) 2,0672 2,6087 2,2239 1,2467
*Em relação às concentrações de trabalho.

Ao analisar a Tabela 21, percebe-se que, para todos os níveis avaliados, não houve
diferença estatística entre soluções amostra de SLD preparadas com diluente
 79

constituído por acetonitrila e água e preparadas com ácido clorídrico 0,01 M. E

também não foi observada diferença estatística entre as soluções amostra de TAD
preparadas com diluente constituído por acetonitrila e água e preparadas com
laurilsulfato de sódio 0,5% (p/v), uma vez que Fcalculado foi inferior ao Ftabelado em
ambos os casos. Então, não há diferença estatística entre as médias dos grupos
comparados.

Sendo assim, conclui-se que o método analítico desenvolvido e validado conforme

descrito anteriormente, pode ser aplicado nos testes de identificação, doseamento,
uniformidade de conteúdo e também, para a determinação da cedência de
comprimidos contendo SLD e TAD quando são utilizados como meios de dissolução
ácido clorídrico 0,01 M para comprimidos contendo SLD e laurilsulfato de sódio 0,5%
(p/v) para comprimidos contendo TAD.

6.8 Propostas de elucidação estrutural dos principais produtos de degradação

Os espectros de absorção no ultravioleta e de massas das soluções padrão

contendo citrato de SLD e TAD a 100 µg/mL e amostras provenientes da
degradação em meio ácido, alcalino e oxidativo foram obtidas utilizando-se um
sistema UHPLC-Q-TOF-MS. Os espectros de massas de fragmentação e aqueles
fornecidos pelo detector ultravioleta, para as amostras analisadas são apresentados
nas Figuras 14 e 15.

SLD apresentou íon precursor ([M + H]+) com razão m/z de 475,21 e íon produto
com m/z de 100,10 (Figura 14A e 14B). Para a TAD o íon precursor apresentou
razão m/z de 390,15 e principal fragmento com m/z de 268,11, como mostrado na
Figura 15B. Os íons precursores e os principais íons produto obtidos para os
produtos de degradação majoritários, PD5 e PD6, foram m/z 491,21 → m/z 99,09
(Figura 14D) e m/z 390,14 → m/z 268,11, respectivamente (Figura 15D).
 80

Figura 14 – Espectro no UV do SLD (A); espectro de fragmentação (MS2 full-scan) do SLD (B);
espectro no UV do PD5 (C) e espectro de fragmentação (MS2 full-scan) do PD5.

Figura 15 – Espectros no UV da TAD e do PD6 sobrepostos (A); espectro de fragmentação

(MS2 full-scan) da TAD (B); espectro de varredura (MS1 full-scan) da TAD (C) e espectro de
varredura (MS1 full-scan) do PD6.

Em meio oxidativo, SLD formou PD5 (m/z 491,20 → m/z 99,09), que provavelmente
corresponde ao N-óxido de sildenafila, de fórmula molecular C22H30N6O5S, derivado
 81

do mecanismo de oxidação de aminas terciárias a óxidos de amina (HOVORKA;

SCHÖNEICH, 2001). A proposta de mecanismo de formação do PD5 encontra-se na
Figura 16.

Figura 16 – Proposta de mecanismo de formação e estrutura do PD5.

Na Figura 14C é apresentado o espectro no UV do PD5 e na Figura 14D é mostrado

o espectro de massas de fragmentação (MS2 full-scan) e a provável estrutura
química do PD5 (ACEÑA et al., 2014).

O principal produto de degradação proveniente da TAD, formado em meios ácido e

alcalino (PD6), além de possuir os mesmos tempos de retenção, apresentaram o
mesmo espectro UV e de massas na análise por UHPLC-Q-TOF-MS. O
comprimento de onda máximo da TAD e do PD6 diferiu em 2 nm (Figura 15A) e o
espectro de varredura (MS1 full-scan) mostraram uma diferença de ionização entre
esses compostos, com PD6 apresentando um sinal significativamente mais intenso
referente a [2M+H]+ do que o sinal observado no espectro da TAD (Figura 15C e
15D). No entanto, PD6 e TAD não podem ser diferenciados pelo espectro de
 82

fragmentação (MS2 full-scan). Dessa forma, provavelmente, PD6 trata-se de um

diastereoisômero da TAD.

Como pode ser observado na Figura 1B, a TAD é um composto opticamente ativo.
Ela contém dois centros quirais de configuração 6R,12aR e, pode haver dois
estereoisômeros cis (6R,12aR / 6S,12aS) e dois trans (6R,12aS / 6S,12aR) para
essa molécula (KEE et al., 2019).

Venhuis et al. (2010) descreveram um método por HPLC-DAD-MS capaz de separar

a TAD do diastereoisômero trans-tadalafila encontrados em medicamentos
falsificados. Para identificar de qual dos diastereorisômeros se tratava (a TAD é o
6R,12aR e os possíveis diastereoisômeros são 6R,12aS ou 6S,12aR), os
pesquisadores realizaram um teste de rotação óptica e concluíram que correspondia
ao (-)-trans-tadaladila, ou seja, 6R,12aS. Venhuis e colaboradores (2010)
determinaram também, o espectro de varredura no UV da TAD e do
diastereoisômeto 6R,12aS, mostrando uma diferença de 2 nm entre os máximos de
absorção desses analitos. Adicionalmente, o espectro de massas de varredura (MS1
full-scan) mostrou uma diferença de ionização entre os compostos, de forma que o
diastereoisômero 6R,12aS apresentou um sinal muito mais intenso do íon de m/z
[2M+H]+ do que o sinal referente a esse íon no espectro da TAD, apesar dos dois
não poderem ser distinguidos pelo espectro de fragmentação (MS2 full-scan). Os
resultados referentes aos espectros UV e de massas foram os mesmos obtidos no
presente trabalho para TAD e PD6. Portanto, é provável que PD6 corresponda ao
diastereoisômero 6R,12aS, formado via tautomerismo ceto-enólico de acordo com
os mecanismos mostrados na Figura 17.
 83

Figura 17 – Proposta de mecanismo de formação e estrutura do PD6 via tautomerismo ceto-

enólico em meios ácido (A) e alcalino (B).

Outro fato que corrobora com essa hipótese é que Jida, Tourwé e Ballet (2014)
descreveram que para ser formado o diastereoisômero 6S,12aR a partir da TAD faz-
se necessária a ação de irradiação de micro-ondas, aquecimento extremo e
presença de ácido, uma vez que, para que ocorra a conversão via epimerização, é
necessário abertura de anel e adição intramolecular. Essa reação é muito mais
 84

complicada e difícil de ocorrer, se comparada ao tautomerismo ceto-enólico, que

ocorre em condições de reação mais moderadas, o qual é proposto para a formação
do PD6.

Para comprovar com total segurança de qual diastereoisômero se trata, seria

necessário utilizar a cromatografia quiral, uma vez que os possíveis
diastereoisômeros da TAD são enantiômeros entre si (6R,12aS ou 6S,12aR).
Entretanto, diante das evidências apresentadas, acredita-se que PD6 trata-se do
diastereoisômero 6R,12aS.

6.9 Análise dos medicamentos originais e apreendidos

6.9.1 Caracterização física dos comprimidos originais e apreendidos

A primeira etapa a ser realizada no momento de verificação da autenticidade dos

medicamentos é a avaliação detalhada dos elementos existentes nas embalagens,
como os padrões de impressão (fontes, figuras e hologramas). O passo seguinte
consiste na avaliação do perfil físico dos comprimidos (aspectos visuais, medidas de
dimensões e massa) (ORTIZ et al., 2012a).

Sendo assim, as amostras apreendidas foram fotografadas (Figura 18) e uma

avaliação detalhada dos elementos presentes nas embalagens foi realizada.

As embalagens, apesar de não possuírem homogeneidade na fonte, cor da letra,

nas impressões na folha de alumínio laminado e na coloração do filme de material
plástico, todas, exceto a amostra 3, apresentavam-se rotuladas como “Pramil® -
Sildenafil 50 mg”. A amostra 3 era identificada como “Erectalis® 20 mg – Tadalafil”.
As informações presentes em todas as embalagens primárias continham os dizeres
em espanhol.

Apenas pela análise das embalagens, é possível concluir que as amostras

apreendidas são medicamentos ilegais, uma vez que as mesmas não possuem
registro na ANVISA e, portanto, não podem ser comercializadas em território
brasileiro. Entretanto, devido às nítidas diferenças entre elas, é muito provável que
 85

algumas ou todas as amostras possam ser falsificações dos medicamentos Pramil®

e Erectalis®, os quais possuem registro no Paraguai.

Figura 18 – Imagens das amostras de medicamentos apreendidos disponibilizadas pela PF e

PCMG.

A parte de alumínio do blíster das embalagens das amostras 1, 2, 6 e 8 apresentam-

se muito semelhantes, possuindo a mesma fonte e cor de letra tanto nas
informações contidas no verso, quanto na frente da embalagem, na qual encontram-
se várias vezes a repetição da palavra “PRAMIL”. Nessas embalagens, encontra-se
a mesma sequência de informações no verso: nome do medicamento, IFA, dose,
forma farmacêutica e fabricante. A parte do revestimento plástico tem coloração
azulada nas amostras 2, 6 e 8, mas na amostra 1 o plástico é transparente.
 86

As embalagens das amostras 5, 7 e 10 são diferentes das demais e não apresentam

a palavra “PRAMIL” na parte da frente do alumínio do blíster. A amostra 5 possui
desenho da logomarca da fabricante impresso na cor azul no verso do blíster e o
revestimento plástico do blíster possui coloração amarelada. Na embalagem da
amostra 7 chama atenção a fonte da letra no verso do blíster, a qual é muito
diferente das demais e o filme plástico é transparente. A amostra 10 possui no verso
do blíster a logomarca (colorida) impressa várias vezes e o filme de revestimento do
blíster é azul.

Os medicamentos autênticos, possuem em suas embalagens as informações que

são obrigatórias, de acordo com a RDC nº 71/2009 (ANVISA), que estabelece as
regras para a rotulagem de medicamentos (BRASIL, 2009). Ademais, as suas
embalagens apresentam itens de segurança, tais como: tinta reativa (tinta que reage
quimicamente quando raspada com objeto de metal, possibilitando visualizar a
palavra “Qualidade” e a logomarca da empresa titular do registro), lacre ou selo de
segurança e marcações holográficas.

Em relação às características físicas dos comprimidos apreendidos (Tabela 22),

todas as amostras rotuladas como Pramil, apresentam-se na forma de comprimidos
de cor azul e redondos. Com exceção da amostra 7, todas mostram-se não
seccionadas e têm de um lado gravado a logomarca da empresa e do outro o código
"PR". A amostra 7 é a única que possui ranhura central em um dos lados e a
gravação “50” do outro lado. Os comprimidos da amostra 1 possuem coloração azul
nitidamente mais escura e um formato menos abaulado que as demais amostras
apreendidas.
 87

Tabela 22 – Descrição e características físicas dos medicamentos apreendidos e originais.

Peso Comprimento ou
Espessura
médio diâmetro (mm) /
Amostra Descrição (mm) /
(mg) / DPR (%)
DPR (%)
DPR (%) Maior Menor
Comprimidos de cor azul, redondos, de um
Apreendida 132, 24 / 7,11 / 3,07 /
lado gravado com a logo da empresa e do NA
1 6,7171 0,9731 8,5376
outro gravado "PR".
Comprimidos de cor azul, redondos, de um
Apreendida 125,30 / 7,06 / 3,30 /
lado gravado com a logo da empresa e do NA
2 1,0595 0,9419 2,8020
outro gravado "PR".
Comprimidos de cor amarela, redondos,
Apreendida 189,89 / 8,17 / 3,71 /
com ranhura central em um dos lados e NA
3 0,8635 2,4138 1,6616
liso no outro lado, não possui gravações
Comprimidos de cor azul, redondos, de um
Apreendida 126,13 / 7,11 / 3,14 /
lado gravado com a logo da empresa e do NA
4 0,5279 3,8814 7,4432
outro gravado "PR".
Comprimidos de cor azul, redondos, de um
Apreendida 123,50 / 7,12 / 3,14 /
lado gravado com a logo da empresa e do NA
5 0,5795 1,6360 2,9304
outro gravado "PR".
Comprimidos de cor azul, redondos, de um
Apreendida 125,62 / 7,13 / 3,36 /
lado gravado com a logo da empresa e do NA
6 1,1275 1,1096 1,6817
outro gravado "PR".
Comprimidos de cor azul, redondos, com
Apreendida 124,93 / 7,11 / 3,06 /
ranhura central em um dos lados e liso do NA
7 1,0285 0,7733 1,3972
outro lado, não possui gravações.
Comprimidos de cor azul, redondos, de um
Apreendida 125,51 / 7,11 / 3,41 /
lado gravado com a logo da empresa e do NA
8 0,5066 0,3298 0,9646
outro gravado "PR".
Comprimidos de cor azul, redondos, de um
Apreendida 125,65 / 7,04 / 3,44 /
lado gravado com a logo da empresa e do NA
9 2,5719 1,7087 0,6176
outro gravado "PR".
Comprimidos de cor azul, redondos, de um
Apreendida 127,40 / 7,12 / 3,34 /
lado gravado com a logo da empresa e do NA
10 1,9216 0,5047 3,0800
outro gravado "PR".
Comprimidos de cor azul, losangulares,
316,76 / 11,43 / 8,29 / 4,42 /
Viagra 1 com marcações (um lado “Pfizer” e do
0,9654 1,2581 1,0546 1,1903
outro lado “VGR50”).
Comprimidos de cor azul, losangulares,
314,74 / 11,38 / 8,28 / 4,49 /
Viagra 2 com marcações (um lado “Pfizer” e do
1,1411 0,4384 0,8717 0,8190
outro lado “VGR50”).
Genérico Comprimidos de cor azul, pentagonais, 313,78 / 9,86 / 4,27 /
NA
SLD 1 lisos em ambos os lados, sem marcações. 0,7844 1,1184 1,3776

Genérico Comprimidos de cor azul, oblongos, lisos 304,36 / 13,25 / 6,23 / 4,32 /
SLD 2 em ambos os lados, sem marcações. 0,9276 0,5721 1,2973 0,8840

Comprimidos de cor amarela, em forma de

364,20 / 12,32 / 5,10 /
Cialis amêndoa, identificados em um dos lados NA
0,0660 NR NR
pelo código “C20” e o outro lado liso.
Comprimidos brancos, em forma de
Genérico 370,54 / 12,70 / 5,05 /
amêndoa, lisos em ambos os lados, sem NA
TAD 1 0,3891 0,3393 0,7922
marcações.
Genérico Comprimidos de cor amarela, redondo, 372,30 / 10,26 / 4,91 /
NA
TAD 2 lisos em ambos os lados, sem marcações. 0,7842 0,1009 0,6199
Genérico Comprimidos de cor amarela, redondo, 360,88 / 10,22 / 4,61 /
NA
TAD 3 lisos em ambos os lados, sem marcações. 0,9939 0,3004 0,7462
Legenda: NA = não se aplica; NR = não realizado.
 88

Ao verificar os valores de peso médio (Tabela 22), conclui-se que os comprimidos

rotulados como Pramil apresentam peso médio muito inferior aos comprimidos
contendo SLD autênticos. Da mesma forma, os comprimidos da amostra 3
apresentam massa muito inferior se comparada à massa dos comprimidos contendo
TAD originais. As demais dimensões (comprimento e espessura) dos comprimidos
apreendidos também são inferiores às dos comprimidos autênticos. A amostra
apreendida 1 foi a que apresentou um DPR mais elevado em relação às massas e à
espessura dos comprimidos. Do mesmo modo, os valores de DPR obtidos para o
comprimento e espessura da amostra apreendida 4 foram muito altos. Essa maior
variabilidade pode ser um indício de falta de padronização e ausência de controle de
qualidade rigoroso durante o processo de fabricação destes comprimidos.

Os comprimidos autênticos contendo SLD ou TAD apresentam formatos diferentes

entre si, mas possuem uma padronização adequada entre as unidades de um
mesmo lote, apresentando baixos valores de DPR (inferior a 1,40%) entre as
medições de massa, comprimento e espessura analisadas (Tabela 22). Isto se deve
à utilização de tecnologias avançadas na fabricação dos comprimidos, aplicação das
BPF e de um rigoroso controle de qualidade durante o processo produtivo e antes da
aprovação do lote para comercialização.

Dessa forma, por meio do perfil físico dos comprimidos, foi possível diferenciar e
identificar a ilegalidade dos medicamentos apreendidos, uma vez que todas as
amostras obtidas foram contrabandeadas, ou seja, não possuem registo na ANVISA,
não sendo portando, permitida a sua comercialização no Brasil. A investigação das
embalagens e a determinação das características físicas dos medicamentos é uma
maneira rápida, não destrutiva e reprodutível que pode contribuir para a conclusão
de inautenticidade das amostras apreendidas antes das análises químicas, além de
ser uma perspectiva útil para investigar possível origem da falsificação (ORTIZ et al.,
2012a).
 89

6.9.2 Aplicação do método: avaliação da qualidade dos medicamentos

originais e apreendidos

Para verificar as características dos medicamentos, os quais estão disponíveis ao

usuário no mercado, sejam eles ilegais ou genuínos, aplicou-se o método
desenvolvido e validado na avaliação da qualidade desses produtos.

Ao realizar o teste de doseamento, além de determinar o teor nas amostras, foi

possível proceder à identificação do IFA em cada uma das amostras, por meio da
comparação do tempo de retenção do pico principal obtido no cromatograma das
amostras com o tempo de retenção dos picos obtidos no cromatograma da solução
padrão a 100% das concentrações de trabalho dos fármacos, que foram de 3,44 min
para o SLD e 5,43 min para a TAD. Na Tabela 23 encontram-se os valores de tempo
de retenção e de teor obtidos a partir da análise dos comprimidos originais e
apreendidos.

Tabela 23 – Resultados obtidos no teste de identificação e doseamento das amostras

apreendidas e autênticas contendo SLD e TAD.
Amostra TR (min) IFA identificado Teor (%)
Apreendida 1 3,35 SLD 27,61
Apreendida 2 3,36 SLD 98,09
Apreendida 3 5,51 TAD 101,35
Apreendida 4 3,33 SLD 92,74
Apreendida 5 3,32 SLD 92,78
Apreendida 6 3,32 SLD 97,64
Apreendida 7 3,31 SLD 98,92
Apreendida 8 3,33 SLD 94,82
Apreendida 9 3,30 SLD 93,33
Apreendida 10 3,33 SLD 100,98
Viagra 1 3,31 SLD 99,64
Viagra 2 3,25 SLD 101,21
Genérico SLD 1 3,30 SLD 99,29
Genérico SLD 2 3,31 SLD 98,80
Genérico TAD 1 5,46 TAD 100,80
Genérico TAD 2 5,46 TAD 102,34
Genérico TAD 3 5,44 TAD 100,00

Nos cromatogramas das amostras analisadas, foram observados apenas um pico

referente ao IFA, não estando presente picos secundários relacionados a impurezas
e produtos de degradação. Entretanto, ressalta-se que, o fato de serem
desconhecidos os procedimentos de fabricação, embalagem, transporte e
 90

armazenamento desses produtos, os mesmos podem conter contaminantes

inorgânicos e/ou microbiológicos, por exemplo, os quais não foram avaliados no
presente estudo, e que podem ser prejudiciais à saúde do paciente.

Como pode ser observado ao analisar a Tabela 23, por meio do teste de
identificação pelo tempo de retenção do pico principal, foi possível comprovar que
todas as amostras que continham a descrição do IFA em sua embalagem, realmente
continham esse IFA. Para as amostras que não apresentavam embalagem (4 e 9),
foi possível identificar a presença de SLD nas mesmas.

Em relação ao teste de doseamento, todas as amostras analisadas apresentaram

teor em conformidade com a especificação farmacopeica (mínimo de 90,0% e
máximo de 110,0% do valor rotulado), com exceção da amostra apreendida 1, que
apresentou teor de 27,61% do valor rotulado de SLD, ou seja, correspondente a
13,81 mg de SLD, valor muito inferior à especificação (THE UNITED, 2019).
Algumas amostras apreendidas (4, 5 e 9), apesar de possuírem teor de acordo com
a especificação, apresentaram valores de teor próximo ao limite inferior, o que não
acontece com os medicamentos autênticos, os quais apresentam teores muito
próximos a 100%.

A presença do IFA na formulação em teor adequado à especificação farmacopeica,

durante todo o seu prazo de validade, é fundamental para a qualidade do
medicamento, uma vez que a administração de doses incorretas pelos pacientes
pode provocar inefetividade terapêutica (teor inferior) ou efeitos toxicológicos (teor
superior à especificação), podendo até mesmo ser letal ao paciente.

Quanto ao teste de uniformidade de conteúdo, os resultados estão apresentados na

Tabela 24. Com exceção da amostra apreendida 1, todas as unidades de
comprimidos analisadas apresentaram conteúdo do IFA adequado e VA inferior a
15,0. Os comprimidos da amostra apreendida 1, além de conteúdo de SLD inferior à
especificação, apresentaram grande variação (DPR de 9,21%) entre as unidades
testadas, comprovando mais uma vez a falta de padrões de qualidade durante a
fabricação dessa amostra.
 91

O resultado advindo do teste de uniformidade de doses unitárias é um parâmetro

importante para avaliar se os padrões de qualidade estão sendo seguidos durante a
fabricação do medicamento, uma vez que, uma mistura inadequada ou não
criteriosa do pó dos comprimidos, por exemplo, pode resultar em elevadas variações
de teor entre as unidades de um mesmo lote.

Tabela 24 – Resultados obtidos no teste de uniformidade de conteúdo das amostras

apreendidas e autênticas contendo SLD e TAD.
Valor de
Teor médio
Amostra Comprimido Teor (%) DPR (%) Aceitação
(%)
(VA)
1 25,78
2 25,54
Apreendida 1 26,14 9,21 78,13
3 29,50
4 23,77
1 98,11
Apreendida 2 97,06 1,53 5,01
2 96,01
1 100,96
Apreendida 3 2 101,14 101,75 1,06 2,84
3 101,56
1 96,17
Apreendida 6 98,31 3,07 7,45
2 100,44
1 99,01
2 101,12
Apreendida 10 99,91 0,92 2,20
3 99,45
4 100,06
1 98,83
2 99,20
Viagra 1 99,55 0,85 2,03
3 100,77
4 99,42
1 98,69
Viagra 2 2 102,01 100,08 1,72 4,41
3 99,55
1 100,01
2 99,20
Genérico SLD 1 100,15 0,84 2,02
3 100,11
4 101,25
1 93,36
2 95,85
Genérico SLD 1 95,53 2,02 7,61
3 97,98
4 94,91
1 100,56
Genérico TAD 1 2 99,89 100,65 0,80 1,94
3 101,50
1 102,25
Genérico TAD 2 2 101,94 101,90 0,36 1,27
3 101,52
1 101,31
Genérico TAD 3 2 101,94 102,12 0,89 2,79
3 103,10

Referente ao teste de dissolução, os resultados de cedência após 15 minutos do

início do teste de dissolução das amostras de comprimidos contendo SLD (Tabela
 92

25) mostram que todas as unidades, com exceção da amostra apreendida 1, estão
de acordo com a especificação da Farmacopeia Americana, uma vez que todas
apresentaram cedência superior a 85% (THE UNITED, 2019).

Tabela 25 - Resultados obtidos no teste de dissolução para os comprimidos contendo SLD.

Cedência (%) Cedência média (%)
Amostra Unidade DPR (%)
em 15 min em 15 min
1 27,26
Apreendida 1 2 30,51 28,01 7,92
3 26,27
1 98,99
Apreendida 2 2 100,25 100,01 0,92
3 100,79
1 98,48
2 97,66
Apreendida 5 98,07 0,59
2 96,18
3 94,23
1 99,48
Apreendida 6 100,11 0,89
2 100,74
1 97,57
Apreendida 7 98,39 1,18
2 99,21
1 98,93
Apreendida 8 2 98,87 99,42 0,90
3 100,45
1 99,77
Apreendida 10 2 98,36 98,31 1,51
3 96,81
1 98,82
2 99,60
3 99,23
Viagra 1 100,04 1,06
4 101,59
5 100,98
6 100,04
1 102,61
2 104,92
3 100,69
Viagra 2 103,07 1,51
4 103,97
5 102,10
6 104,12
1 102,66
2 100,35
3 102,43
Genérico SLD 1 100,90 1,80
4 99,65
5 102,16
6 98,16
1 93,24
2 96,18
3 94,23
Genérico SLD 2 94,85 1,49
4 96,04
5 96,09
6 93,34
 93

As unidades da amostra apreendida 1, apresentaram cedência inferior à

especificação, o que já era esperado, uma vez que, de acordo com os resultados
obtidos nos testes de doseamento e uniformidade de conteúdo apresentados
anteriormente, essa amostra possui teor de SLD muito abaixo da especificação.
Além de uma cedência abaixo da especificação, o DPR entre a cedência das
unidades da amostra apreendida 1, também foi elevado (7,92%), indicando uma falta
de padronização entre as unidades, confirmando a ausência de qualidade desses
comprimidos.

A partir dos dados de porcentagens de cedência e dos tempos de coleta (2, 5, 10,
15, 30, 45 e 60 minutos), os perfis de dissolução para os medicamentos originais e
apreendidos contendo SLD foram construídos e são apresentados na Figura 19.
Observa-se que a amostra apreendida 1 libera todo o conteúdo de SLD que possui,
de maneira imediata e o mesmo dissolve no meio de dissolução instantaneamente.
Entretanto, como o conteúdo de SLD nessa amostra é muito baixo, a curva do perfil
de dissolução apresenta-se muito distante das curvas de perfil de dissolução das
demais amostras.

Figura 19 – Perfil de dissolução das amostras contendo SLD.

Em relação às amostras originais, percebe-se que os dois lotes de Viagra e o

genérico SLD 1, apresentam perfis de dissolução muito semelhantes. As amostras
de genérico SLD 1 liberam todo o conteúdo de SLD, que se dissolve no meio
 94

prontamente, uma vez que, no primeiro tempo de coleta (2 minutos) a cedência

média foi de 93,03%.

As amostras apreendidas podem ser divididas em alguns grupos, de maneira que as

amostras 5, 6, 8 e 10 apresentam perfis sobrepostos, a amostra 2 possui perfil
bastante semelhante a esse grupo, entretanto, com liberação e dissolução do SLD
um pouco mais rápida. A amostra 7 apresenta um perfil de liberação um pouco mais
lento que as demais. Mas todas elas liberaram praticamente todo o seu conteúdo de
SLD ao final de 30 minutos.

Os comprimidos são obtidos a partir da compressão de uma mistura contendo o(s)

IFA(s) e excipientes, que apresentam variadas funções. Eles podem ser formulados
de forma a apresentar liberação imediata ou liberação modificada, de acordo com os
excipientes utilizados e os processos de fabricação empregados. Todos os
comprimidos contendo SLD analisados apresentaram liberação imediata e, com
exceção da amostra apreendida 1, todos os lotes mostraram cedência superior a
85% após 15 minutos do início do teste de dissolução.

Para as amostras contendo TAD, os resultados de cedência após 10 e 30 minutos

do início do teste de dissolução são apresentados na Tabela 26.

Tabela 26 - Resultados obtidos no teste de dissolução para os comprimidos contendo TAD.

Cedência média Cedência média
Cedência (%) Cedência (%)
Amostra Unidade (%) / DPR (%) (%) / DPR (%)
em 10 min em 30 min
em 10 min em 30 min
1 50,79 80,76
Apreendida 03 2 52,33 51,79 / 1,68 82,82 81,38 / 1,53
3 52,25 80,57
1 87,60 96,00
Genérico TAD 1 2 91,04 85,40 / 8,21 100,99 97,61 / 3,00
3 77,55 95,85
1 80,08 93,37
Genérico TAD 2 2 87,33 84,15 / 4,41 98,73 96,32 / 2,82
3 85,05 96,85
1 76,11 84,47
Genérico TAD 3 2 78,79 74,69 / 6,65 90,99 86,03 / 5,10
3 69,17 82,64

Os valores de cedência das unidades testadas deve ser de, no mínimo, 45% após
10 minutos do início do teste de dissolução e de, no mínimo, 85% após 30 minutos
 95

(THE UNITED, 2019). Ao avaliar a Tabela 26, pode-se concluir que todas as
unidades apresentaram cedência superior a 45% após 10 minutos de início do teste
de dissolução. Entretanto, todos os comprimidos analisados da amostra apreendida
3 e dois comprimidos do medicamento genérico TAD 3, apresentaram cedência
inferior a 85% após 30 minutos do início do teste. Dessa forma, essas amostras não
atendem ao critério de aceitação do primeiro estágio (E1) do teste de dissolução
(THE UNITED, 2019).

As curvas de perfil de dissolução obtidas a partir das cedências médias nos tempos
de coleta são mostradas na Figura 20. Observa-se que os lotes dos genéricos TAD
1 e TAD 2 possuem perfis de dissolução muito semelhantes. Os comprimidos do
medicamento genérico TAD 3 apresentaram uma dissolução um pouco mais lenta
que os anteriores e a amostra apreendida 3 apresentou dissolução ainda mais lenta
e, esses dois últimos não atenderam ao critério do teste de dissolução, uma vez que
a cedências das unidades testadas foi inferior a 85% em 30 minutos após o início do
teste de dissolução.

Figura 20 – Perfil de dissolução das amostras contendo TAD.

A principal função do teste de perfil de dissolução no controle de qualidade na

indústria farmacêutica é a verificação da manutenção das características e
parâmetros de qualidade entre diferentes lotes de um medicamento, uma vez que
alterações no perfil de dissolução são indicativos de alguma alteração nos
constituintes ou procedimentos de fabricação da formulação (ABDOU, 1989;
 96

STORPIRTIS et al., 1999), o que pode representar falta de padronização e afetar a

qualidade da formulação.

É imprescindível que um medicamento apresente a ação farmacológica desejada e

perfil toxicológico seguro. A qualidade dos medicamentos é uma exigência não
apenas regulatória, mas também de caráter ético e moral e o seu não cumprimento
pode provocar graves consequências à saúde pública. O acesso a medicamentos
com desvio de qualidade pode colocar em risco a vida do paciente e onerar ainda
mais o sistema de saúde (GIL, 2010; LOMBARDO; ESERIAN, 2017; LUIZA;
CASTRO; NUNES, 1999).

Um dos controles estabelecidos pelas agências regulatórias em relação aos

produtos farmacêuticos, refere-se à concessão do registro sanitário, de maneira que,
apenas medicamentos registrados podem ser produzidos e comercializados no país
(BRASIL, 1976). A finalidade primordial do registro é garantir que sejam
comercializados apenas medicamentos com segurança e eficácia cientificamente
comprovadas (LYRA; DELDUQUE, 2010). Dessa forma, ao adentrar ilegalmente no
país, os medicamentos não registrados, assumem a natureza de contrabando
(ANVISA, 2006) e podem promover sérias consequências à saúde pública, uma vez
que não se tem conhecimento e controle da sua produção, transporte e
armazenamento.

Quanto à etapa de fabricação, para atingir os pilares que garantem o sucesso

terapêutico, deve-se assegurar a produção consistente e controlada dos
medicamentos por meio do cumprimento das BPF e, compete ao setor de controle
de qualidade realizar análises capazes de verificar a conformidade do produto com
as especificações oficialmente reconhecidas (BRASIL, 2019).

Não apenas durante a sua fabricação, mas uma vez disponível no mercado, é
necessário garantir a qualidade dos medicamentos. Nesse contexto, ressalta-se a
importância das agências regulatórias e dos laboratórios oficiais, na avaliação da
qualidade de produtos envolvidos em queixas e denúncias, bem como na
participação em programas periódicos para o monitoramento de produtos
comercializados ou distribuídos à população (LOMBARDO; ESERIAN, 2017).
 97

7 CONCLUSÕES

Foi realizado estudo de degradação forçada completo, no qual SLD e TAD IFA foram
submetidos às diversas condições de degradação forçada, que viabilizou o
desenvolvimento de um método simples, rápido e seletivo para SLD e TAD na
presença de seus produtos de degradação utilizando UHPLC-UV. Nesse método
oito analitos foram adequadamente separados em menos de 6 minutos.

O método indicativo de estabilidade desenvolvido foi validado mostrando-se seletivo,

linear, preciso, exato e robusto e pode ser usado tanto para estudos de estabilidade
quanto para análises de controle de qualidade de rotina na indústria farmacêutica e
por laboratórios oficiais de saúde pública.

O SLD apresentou-se susceptível à degradação em meio oxidativo com peróxido de

hidrogênio, enquanto a TAD degradou em meio ácido, alcalino e oxidativo. Nesse
sentido, o uso de adjuvantes e materiais de embalagem adequados deve ser
considerados durante o desenvolvimento dos medicamentos. Foram propostas as
estruturas químicas e mecanismos de formação dos produtos de degradação
majoritários utilizando-se UHPLC-Q-TOF-MS.

Aplicou-se o método por UHPLC-UV para a avaliação da qualidade de

medicamentos autênticos e apreendidos pelas PF e PCMG. Algumas amostras não
atenderam aos parâmetros farmacopeicos de qualidade. Embora não tenham sido
encontrados produtos de degradação nas amostras ilegais, os principais problemas
observados nos medicamentos foram falta de padronização, teor abaixo da
especificação, alta variação no conteúdo entre as unidades do mesmo lote e não
atendimento à especificação do teste de dissolução, resultados que comprometem o
efeito farmacológico desejado.

O uso de medicamentos ilegais pode representar uma séria ameaça à saúde e, a

averiguação da qualidade dos medicamentos aos quais a população está tendo
acesso é de extrema importância, e é recomendada que seja realizada
periodicamente pelas agências regulatórias em prol da segurança dos pacientes e
efetividade do tratamento.
 98

CAPÍTULO II: QUANTIFICAÇÃO DE SILDENAFILA, N-DESMETIL SILDENAFILA,

TADALAFILA E OUTROS SEIS FÁRMACOS UTILIZADOS NO TRATAMENTO DA
HIPERTENSÃO ARTERIAL PULMONAR EM PLASMA HUMANO

1 INTRODUÇÃO

A Hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma síndrome clínica e hemodinâmica que

resulta no aumento da resistência vascular na pequena circulação, elevando os
níveis pressóricos na circulação pulmonar. Apesar da HAP ser uma doença rara, é
grave e progressiva. Os protocolos clínicos para o seu tratamento incluem medidas
não farmacológicas, tratamento medicamentoso específico (antagonistas de canal
de cálcio, inibidores da PDE-5, análogos de prostaciclinas e antagonistas dos
receptores de endotelina) e tratamento adjuvante (anticoagulantes, diuréticos e
digitálicos) (BRASIL, 2014; CALLOU, 2009; ESC, 2016).

Em razão da gravidade da HAP, da complexidade da terapêutica e da diferente

evolução dos pacientes, faz-se necessária a individualização posológica e a
otimização do tratamento farmacológico, com o objetivo de alcançar a máxima
eficácia terapêutica com a mínima incidência de efeitos adversos. Portanto, justifica-
se a monitorização terapêutica e, então, a necessidade de métodos bioanalíticos
que contemplem a análise dos fármacos incluídos na terapia da HAP. Esses
métodos apresentam, também, aplicabilidade nos estudos farmacocinéticos, de
biodisponibilidade e bioequivalência.

Os métodos bioanalíticos constituem-se por uma etapa de preparo de amostra,

seguida pela aplicação de uma técnica analítica de separação e detecção que
possibilite a quantificação dos fármacos e metabólitos na matriz biológica
(CASSIANO et al., 2006; QUEIROZ et al., 2001).

Técnicas de preparo de amostra baseadas em microextração, capazes de remover

interferentes da matriz e concentrar os analitos de interesse de maneira rápida,
simples, com a utilização de pequenos volumes de amostra e solventes, vêm sendo
desenvolvidas como alternativas aos métodos clássicos de extração. Uma dessas
técnicas é a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME, em inglês Dispersive
 99

liquid-liquid microextraction). A extração utilizando a DLLME se deve ao processo de

partição, ou seja, ao equilíbrio de distribuição do analito entre as fases doadora
(amostra aquosa) e aceptora (solvente orgânico). É utilizado um sistema ternário de
solventes, constituído pela amostra aquosa, solvente dispersante e solvente extrator,
o que faz com que o estado de equilíbrio seja alcançado rapidamente. Essa técnica
apresenta como principais vantagens o gasto de pequenos volumes de solventes,
baixo custo, rapidez, alta eficiência de extração e pré-concentração, bem como
potencial para aplicação em diferentes matrizes aquosas, incluindo o plasma
(MARTINS et al., 2012; SARAJI; BOROUJENI, 2014).

Quanto à etapa de separação e detecção, a cromatografia líquida de alta eficiência

acoplada à espectrometria de massas sequencial (HPLC-MS/MS) proporciona
detectabilidade e seletividade adequadas para a determinação de fármacos e
metabólitos em matrizes biológicas e, por isso, é considerada a técnica de escolha
no desenvolvimento de métodos bioanalíticos (PATEL et al., 2012, SHEN et al.,
2012).

Estão disponíveis na literatura, estudos que contemplam métodos bioanalíticos para

a quantificação de SLD e/ou TAD em plasma humano. No entanto, não são
encontrados métodos para a quantificação simultânea de SLD, TAD e outros
fármacos presentes no protocolo terapêutico da HAP.

Ressalta-se ainda, a importância e aplicabilidade de métodos multifármacos, uma

vez que um único método pode ser aplicado para quantificar diferentes fármacos
administrados por um mesmo paciente, além de um único método poder ser utilizado
na quantificação de fármacos em plasma de pacientes submetidos a diferentes
tratamentos.

Diante do exposto, é apresentado neste Capítulo, o desenvolvimento, validação e

aplicação de método bioanalítico para quantificação simultânea de TAD, SLD, seu
metabólito N-desmetil sildenafila (N-DMS) e outros fármacos empregados no
tratamento da HAP: besilato de anlodipino (ANLO), bumetanida (BUM), digoxina
(DGX), cloridrato de diltiazem (DTZ), nifedipino (NIF) e varfarina (VAR), em plasma
humano por HPLC-MS/MS, utilizando a DLLME na etapa de preparo de amostra.
 100

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Desenvolver e validar método bioanalítico para quantificação simultânea de TAD,

SLD, seu metabólito N-DMS e outros seis fármacos (ANLO, BUM, DGX, DTZ, NIF e
VAR) utilizados no tratamento farmacológico específico e adjuvante da HAP, em
plasma humano por HPLC-MS/MS, utilizando a DLLME na etapa de preparo de
amostra.

2.2 Objetivos específicos

• Desenvolver método por HPLC-MS/MS para a determinação simultânea de

oito fármacos (SLD, TAD, ANLO, BUM, DGX, DTZ, NIF e VAR) e um
metabólito (N-DMS).
• Otimizar a etapa de preparo de amostra, para extração dos nove analitos de
interesse do plasma humano utilizando a técnica DLLME.
• Validar o método bioanalítico desenvolvido e otimizado seguindo as
preconizações descritas nos guias nacional e internacionais.
• Aplicar o método bioanalítico desenvolvido e validado na análise de amostras
de voluntários que fazem uso de algum dos fármacos abordados no presente
estudo.
 101

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Métodos bioanalíticos

Os métodos bioanalíticos são aqueles utilizados para a determinação quantitativa de

fármacos e de seus metabólitos em amostras biológicas. Apresentam fundamental
importância para o diagnóstico clínico, monitorização terapêutica, análises
toxicológicas, em estudos farmacocinéticos, de biodisponibilidade e bioequivalência
(FDA, 2018; SHAH, 2007).

A HPLC-MS/MS é a técnica de escolha para o desenvolvimento de métodos

bioanalíticos, uma vez que garante detectabilidade e seletividade adequadas para a
análise de fármacos e metabólitos em matrizes biológicas (PATEL et al., 2012;
SHEN et al., 2012).

Em relação à detecção do método bioanalítico, a espectrometria de massas é capaz

de fornecer informações moleculares altamente específicas e, assim, representa
uma poderosa ferramenta para análises de substâncias presentes em amostras
complexas (SHEN et al., 2012). O princípio da espectrometria de massas é a
produção de íons a partir dos analitos, os quais são filtrados e detectados em função
de sua razão massa/carga (m/z). Na espectrometria de massas sequencial (MS/MS)
dois analisadores de massas são acoplados. Dessa forma, é possível selecionar
determinado(s) íon(s) no primeiro analisador, fragmentá-lo(s) e avaliá-lo(s) no
segundo analisador favorecendo, assim, a seletividade do método (SINGH et al.,
2012).

No entanto, quando essa técnica é aplicada em amostras complexas, como sangue,

plasma e soro, ocorrem algumas dificuldades, tendo em vista a complexidade destas
matrizes. Uma grande diversidade de interferentes endógenos está presente nesses
fluidos, tais como, proteínas, sais, lipídeos e anticoagulantes (CASSIANO et al.,
2006). Esses componentes podem levar à redução da estabilidade do fármaco na
solução final da extração e são, muitas vezes, incompatíveis com as colunas
cromatográficas e com os espectrômetros de massas, provocando degradação,
entupimento da coluna e/ou efeito matriz (BRÊTAS, 2014; CHANG et al., 2007).
 102

Desse modo, é necessário realizar uma etapa prévia que possibilite a extração e/ou
pré-concentração dos analitos, conhecida como preparo de amostra, a qual deve
resultar em recuperação máxima do analito e minimizar a extração de interferentes
da matriz biológica (QUEIROZ et al., 2001).

3.1.1 Preparo de amostra

Os objetivos da etapa de preparo de amostra são: remover os potenciais

interferentes, ajustar o solvente da amostra para garantir compatibilidade com a
análise subsequente, permitir concentração dos analitos dentro da faixa de trabalho
e aumentar a seletividade e detectabilidade do método bioanalítico (CHANG et al.,
2007).

Dentre as técnicas convencionalmente utilizadas para o preparo de amostras

biológicas encontram-se a precipitação de proteínas (PPT, em inglês Protein
precipitation), extração em fase sólida (SPE, em inglês Solid phase extraction) e
extração líquido-líquido (LLE, em inglês Liquid-liquid extraction).

As proteínas geralmente não são compatíveis com sistemas cromatográficos, não

são voláteis e promovem interferências na maioria dos detectores. Dessa forma, o
emprego da PPT visa eliminar as ligações entre as proteínas e os fármacos, para
que seja possível a quantificação deste. A PPT é uma técnica de preparo de
amostra antiga, mas ainda frequentemente empregada, inclusive como precursora
de outras técnicas, devido à sua rapidez e simplicidade (CHANG et al., 2007;
POLSON, 2003).

Os mecanismos envolvidos na PPT são diversos e ocorrem na presença de

solventes orgânicos, sais, ácidos ou bases fortes e metais. Os solventes orgânicos
interferem tanto nas interações hidrofóbicas intramoleculares quanto reduzem a
hidratação da proteína, facilitando as interações eletrostáticas entre elas e
resultando na agregação. A presença de sais afeta o estado de hidratação das
proteínas, uma vez que ocorre o deslocamento das moléculas de água para
solvatação do sal e então, uma menor hidratação da proteína promove a redução da
sua solubilidade. Os ácidos e bases alteram o estado de ionização das proteínas,
 103

provocando a sua desnaturação. Os íons metálicos, por sua vez, levam à

precipitação por alterarem o ponto isoelétrico da proteína e deslocarem os prótons
dos sítios de ligação coordenada nos aminoácidos expostos, resultando na redução
do pH da solução. Após a adição do agente precipitante, as proteínas são removidas
por centrifugação e o sobrenadante é utilizado para prosseguir à análise (CHANG et
al., 2007; POLSON, 2003).

A SPE, por sua vez, consiste na utilização de sorventes empacotados em cartuchos

com formato de seringa ou discos, e os mecanismos de retenção são idênticos
àqueles envolvidos em cromatografia, permitindo assim, a extração de analitos com
variadas características (hidrofílicos, lipofílicos, básicos, neutros ou ácidos). Apesar
de fornecer extratos mais limpos, altas recuperações dos analitos e da facilidade de
automação, a SPE possui como desvantagens o fato de necessitar de grandes
volumes de amostra e solvente(s), a possibilidade de entupimento do cartucho e os
gastos com a constante aquisição dos mesmos (CHANG et al., 2007; QUEIROZ et
al., 2001; RANI et al., 2012).

Na LLE, a extração do analito da matriz ocorre por meio da solubilidade diferencial e

do equilíbrio de partição de moléculas do analito entre duas fases imiscíveis
(orgânica e aquosa). Conforme relatado por Queiroz e colaboradores (2001), a
eficiência da extração depende da afinidade do soluto pelo solvente extrator, da
razão das fases e do número de extrações. Para alguns sistemas, o valor do
coeficiente de partição ou distribuição (KD), entre as fases, pode ser aumentado pelo
ajuste do pH, para prevenir a ionização de ácidos ou bases, pela formação de par
iônico com solutos ionizáveis, pela geração de complexos lipofílicos com íons
metálicos ou pela adição de sais neutros, para diminuir a solubilidade de compostos
orgânicos na fase aquosa. A constante KD é determinada conforme equação a
seguir:

Ao final da extração, as fases podem ser separadas por gravidade, centrifugação,

membrana semipermeável, adsorção de uma das fases a um suporte ou separação
 104

física (pipetagem, congelamento, decantação ou sucção). Essa técnica se mostra

vantajosa por ser simples, de fácil reprodução, permitir a utilização de diferentes
solventes disponíveis comercialmente para que seja possível conseguir solubilidade
e seletividade adequadas. Entretanto, apresenta desvantagens, tais como baixa
extração pelo solvente orgânico de analitos com alta afinidade pela água, resultando
em perda do analito, possibilidade de formação de emulsões, o que resulta em
grande consumo de tempo e necessidade de volumes relativamente grandes de
amostras e de solventes (CHANG et al., 2007; QUEIROZ et al., 2001).

A etapa de preparo de amostra geralmente é a que demanda mais tempo, envolve

mais esforços e consumo de solventes orgânicos. Por isso, o desenvolvimento de
novas técnicas de extração em matrizes complexas, que sejam eficientes, rápidas e
econômicas, têm o objetivo de aumentar a velocidade de análise, precisão, exatidão,
sensibilidade e reduzir o gasto de amostras e solventes a fim de se evitar, ao
máximo, a produção de resíduos tóxicos que podem ser prejudiciais tanto ao meio
ambiente, quanto à saúde do analista (SARAJI; BOROUJENI, 2014; WILLE;
LAMBERT, 2007). Dentre as abordagens que objetivam miniaturizar a LLE,
encontra-se a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME, em inglês dispersive
liquid-liquid microextraction).

3.1.1.1 DLLME

A DLLME foi descrita em 2006 por Rezaee e colaboradores. Devido à sua

simplicidade de operação, curto tempo de extração, baixo custo, alta recuperação e
baixo consumo de solventes orgânicos e reagentes, a DLLME vem sendo aplicada
para a determinação de uma grande variedade de analitos orgânicos e inorgânicos
em diferentes matrizes, tais como amostras clínicas, forenses, alimentícias e
ambientais (SARAJI; BOROUJENI, 2014).

A extração com essa técnica se deve ao processo de partição, ou seja, equilíbrio de

distribuição do analito entre as fases doadora (amostra aquosa) e aceptora (solvente
orgânico) e é ideal para a extração de analitos com propriedades lipofílicas
moderadas a altas ou que possam ter seu coeficiente de distribuição (KD) alterado
 105

pelo controle do pH, ou seja, analitos ionizáveis (MOREIRA et al., 2014; ZANG et al.,
2009).

Na DLLME é utilizado um sistema ternário de solventes, constituído pela amostra

aquosa, solvente dispersante (miscível tanto com a amostra aquosa quanto com o
solvente extrator) e extrator, o que faz com que o estado de equilíbrio seja
alcançado rapidamente. O procedimento convencional para a realização da técnica
é ilustrado na Figura 21 e consiste em injetar rapidamente na amostra aquosa, com
o auxílio de uma seringa, uma mistura contendo o solvente extrator e dispersante,
resultando em uma preparação turva, devido a gotículas do solvente extrator
dispersas na amostra. Dessa forma, uma área de contato infinitamente grande é
gerada entre a fase aquosa e o solvente de extração e, então, os analitos são
extraídos para a fase extratora rapidamente. Após a centrifugação, as gotículas do
solvente extrator se depositam no fundo do tubo e esse sedimento é coletado com
uma microseringa para posterior análise (MARTINS et al., 2012; SARAJI;
BOROUJENI, 2014).

Figura 21 – Esquema ilustrativo das etapas envolvidas na DLLME.

Fonte: adaptado de Saraji; Boroujeni, 2014.

Para otimizar a extração, é necessário estudar o efeito dos parâmetros

experimentais que podem influenciar no desempenho da DLLME, dentre eles, o tipo
e volume dos solventes extrator e dispersante, a presença de sais na fase aquosa e
 106

a alteração do pH da fase aquosa (REZAEE et al., 2006; SARAJI; BOROUJENI,

2014).

Há diversos estudos na literatura que aplicam a DLLME no preparo de amostra para

determinação de fármacos e metabólitos em matrizes biológicas. Dentre os
trabalhos encontrados que utilizam a técnica DLLME para extração e concentração
de analitos do plasma, pode-se citar o estudo de Jouyban e colaboradores (2015)
que desenvolverem e validaram um método para quantificação simultânea de
metoprolol, propranolol, carvedilol, diltiazem e verapamil por HPLC-UV utilizando
DLLME na etapa de preparo de amostra. Nesse trabalho foram utilizados 660 µL de
plasma, realizou-se etapa prévia de PPT, com adição de acetonitrila, a qual atuou
como solvente dispersante na DLLME. Diclorometano foi o solvente extrator
escolhido e a fase aquosa teve adição de cloreto de sódio a 1% (p/v) e pH ajustado
para 11,5. Alcantara e colaboradores (2020) também descreveram um método para
quantificação de risperidona e seu metabólito 9-hidroxirisperidona, utilizando DLLME
e HPLC-MS/MS. Os autores utilizaram clorobenzeno e acetona como solventes
extratores e dispersante, respectivamente, o pH da amostra foi ajustado para 12,0 e
foi adicionado cloreto de sódio a 10% (p/v).

Encontram-se também descritos na literatura, trabalhos que utilizam mais de um

meio de promover a dispersão do solvente extrator na fase aquosa, como a DLLME
assistida por vórtex e DLLME assistida por ultrassom, como justificativa para a
formação de mais gotículas e aumento da taxa de transferência de massa e
eficiência de extração (RUTKOWSKA et al., 2017; SEIDI; YAMINI, 2012). Para
exemplificar essa utilização, cita-se o trabalho de Feriduni e colaboradoes (2018)
que desenvolveram DLLME em pequena escala para quantificação de ácido
valproico e seu metabólito (3-heptanone) em plasma humano. Para isso, realizaram
uma etapa prévia de PPT adicionando ácido trifluoroacético (50 µL) a 500 µL da
amostra. Em seguida, uma mistura de clorofórmio (20 µL, solvente extrator) e
acetonitrila (60 µL, solvente dispersante) foi rapidamente injetada por uma seringa
ao sobrenadante da PPT. Para produzir mais turbidez, ou seja, aumentar a
superfície de contato entre o solvente extrator e a amostra, agitaram a amostra em
vórtex por três minutos. A mistura foi então centrifugada para quebrar a emulsão e a
fase orgânica foi coletada.
 107

Após a remoção dos interferentes e a concentração dos analitos, a amostra deve ser
analisada utilizando-se técnicas de separação e detecção.

3.1.2 Métodos bioanalíticos para quantificação de SLD e TAD em plasma

humano

Após a administração de uma dose oral em jejum, o SLD é prontamente absorvido e

metabolizado, predominantemente por via hepática (citocromo P450), com formação
do metabólito ativo N-DMS (SIMIELE et al., 2015).

O metabólito apresenta um perfil de seletividade para as fosfodiesterases

semelhante ao do SLD e uma potência de inibição in vitro para a PDE-5 de,
aproximadamente, 50% daquela verificada para o fármaco inalterado. A
concentração plasmática do N-DMS é de, aproximadamente, 40% daquela verificada
para o SLD. O N-DMS é amplamente metabolizado, apresentando uma meia-vida de
eliminação (t1/2) de, aproximadamente, quatro horas, enquanto o SLD apresenta t1/2
de três a cinco horas. O SLD e o N-DMS apresentam ligação às proteínas
plasmáticas de, aproximadamente, 96%. Após administração oral, o SLD é
excretado sob a forma de metabólitos, predominantemente nas fezes e em menor
quantidade na urina (ANVISA, 2020a).

Nichols, Muirhead e Harness (2002) realizaram um estudo farmacocinético para SLD

e N-DMS e, após a administração oral de uma dose de 50 mg de SLD, obtiveram
concentração plasmática máxima (Cmáx) para o SLD de 271 ng/mL e de 126 ng/mL
para o N-DMS após 47,4 e 46,8 minutos, respectivamente.

A TAD também é rapidamente absorvida após administração oral e a Cmáx é atingida

em um tempo médio de duas horas após a administração. Apresenta ligação a
proteínas plasmáticas de 94%. É predominantemente metabolizada pelo citocromo
P450 e o maior metabólito circulante é a glucuronida metilcatecol. A TAD também é
excretada predominantemente como metabólitos, principalmente nas fezes e, em
menor extensão, na urina (ANVISA, 2020a).
 108

No estudo relatado por Forgue e colaboradores (2005), após duas horas da

administração de comprimidos contendo 20 mg de TAD, a Cmáx observada foi de 378
ng/mL e t1/2 de 17,5 horas (11,5 a 29,6 horas). A farmacocinética da TAD
apresentou-se linear em relação à dose e ao tempo, e não é afetada por alimentos.

Encontram-se na literatura, muitos estudos nos quais são apresentados métodos

bioanalíticos para a determinação de SLD e/ou TAD em plasma humano. Alguns
desses, são descritos na Tabela 27. Como pode ser observado, há vários métodos
para a quantificação de SLD e TAD de forma isolada, além de existir um número
significativo de métodos para a quantificação simultânea de SLD e seu metabólito N-
DMS. Os métodos descritos por Rust et al. (2012) e Xiao et al. (2013) são
destinados a quantificação de SLD e TAD, além de outros fármacos da classe dos
inibidores da PDE-5. Apenas o método descrito por Yokoyama e colaboradores
(2014) contempla a quantificação simultânea de SLD, TAD, bosentana e
ambrisentana, fármacos para tratamento específico da HAP, no qual foi utilizado
SPE e HPLC-MS/MS.

Nos métodos encontrados, são gastos volumes de plasma que variam de 200 a
1500 µL e a técnica de preparo de amostra predominantemente empregada é a LLE.
Entretanto, Xiao e colaboradores (2013) utilizaram a DLLME baseada em líquido
iônico para extrair SLD, vardenafila e aildenafila do plasma. Os líquidos iônicos são
compostos por cátions e ânions orgânicos ou inorgânicos e podem ser utilizados na
DLLME como solvente extrator, substituindo os solventes clorados, comumente
empregados.

Dentre as técnicas de separação, é predominante o uso da HPLC e, para a

detecção, há métodos nos quais são utilizados o detector ultravioleta e em outros, o
espectrômetro de massas, com a justificativa de obter método mais seletivos e com
menor limite de quantificação.
 109

Tabela 27 – Métodos bioanalíticos para a determinação de SLD e TAD em plasma humano.

Volume
Preparo Faixa
Padrão(ões) de Solvente/ Recupera-
Referência Analito(s) Aplicação de Cromatografia Detecção validada
interno(s) amostra sorvente ção (%)
amostra (ng/mL)
(µL)
AL-HROUB et al., SLD Monitorização Etoricoxibe 750 LLE Éter etílico HPLC UV 2-200 Maior que
2016 terapêutica e C18 (150,0 × 4,6 mm, 230 nm 78,4
estudos 5,0 μm)
farmacocinéticos Acetonitrila: água
(37:63 v/v) com
trietilamina 0,1%
(v/v) pH 7,7
GOFFREDO et SLD e N-DMS Monitorização Butilparabeno 500 LLE Acetato de etila HPLC UV 1–250 102,5
al., 2016 terapêutica e C18 (150,0 × 4,6 mm, 230 nm (SLD)
estudos 5,0 μm) 101,8
farmacocinéticos Acetonitrila: tampão (N-DMS)
fosfato 30 mM pH
6,0 (47:53 v/v)
SIMIELE et al., SLD e N-DMS Monitorização Quinoxalina 200 PPT Acetonitrila UHPLC MS/MS 3,9-1000,0 83,2
2015 terapêutica e C18 (150,0 × 2,1 mm, 475→283 (SLD)
estudos 1,8 μm) (SLD) 84,5
farmacocinéticos Acetonitrila com 461→85 (N-DMS)
ácido fórmico 0,05% (N-DMS)
(v/v): solução
aquosa com ácido
fórmico 0,1% (v/v)
(gradiente)
LIEW et al., 2014 SLD e N-DMS Estudos de Loperamida 500 LLE Éter etílico HPLC MS/MS 10–800 65,54-72,12
farmacocinética e C18 (100,0 × 2,1 mm, 475→58 (SLD) (SLD)
bioequivalência 2,6 μm) (SLD) 10-600 48,66-56,14
Metanol:solução 461→85 (N-DMS) (N-DMS)
aquosa com ácido (N-DMS)
fórmico 0,1% (v/v)
(80:20 v/v)
TANG et al., 2014 SLD e N-DMS Monitorização Não informado 1500 Extração Metilcelulose HPLC UV 5–400 Não
terapêutica em fase revestido- C18 (150,0 × 2,1 mm, 290 nm (SLD) informado
sólida Fe3O4–SiO2– 2,2 μm) 2,5-400
magnética fenil Metanol:solução (N-DMS)
(MSPE) aquosa de ácido
acético 1% (v/v)
(62:38 v/v)
 110

Tabela 27 – Métodos bioanalíticos para a determinação de SLD e TAD em plasma humano (continuação).
Volume
Preparo Faixa
Padrão(ões) de Solvente/ Recupera-
Referência Analito(s) Aplicação de Cromatografia Detecção validada
interno(s) amostra sorvente ção (%)
amostra (ng/mL)
(µL)
YOKOYAMA et SLD, TAD, Estudo SLD d-3 50 SPE Copolímero HPLC MS/MS 2-1000 83,4–88,1
al., 2014 bosentana e farmacocinético em TAD d-3 C18 (75,0 × 2,0 mm, 475→58 (SLD),
ambrisentana, pacientes bosentana d-3 3,0 μm) (SLD) 78,9–88,5
pediátricos com ambrisentana d-3 Acetonitrila:acetato 478→61 (TAD)
HAP de amônio 5 mM (SLD d-3)
(45:55 v/v, pH 5,0) 390→268
(TAD)
393→271
(TAD d-3)
XIAO et al., 2013 SLD, Estudos clínicos e Não utilizado 960 Microextra Metanol HPLC UV 1-500 100,4
vardenafila e forenses ção (solvente C18 (250,0 × 4,6 mm, 254 nm (SLD)
aildenafila líquido- dispersante) 5,0 μm)
líquido e 1-hexafluo- Metanol:solução
dispersiva rofosfato de aquosa de ácido
(DLLME) octil-3- acético 1% (v/v)
baseada metilimidazólio (40:60 v/v)
em líquido como líquido
iônico (IL) iônico
YAROSHENKO et SLD Estudos clínicos Trazodona 500 SPE C18 HPLC UV 20-1000 95,0±4,0
al., 2013 C18 (100,0 × 2,1 mm, 290 nm
3,5 μm)
Acetonitrila:tampão MS 5-1000
acetato de amônio 475 (SLD)
40 mM (40:60 v/v)
RUST et al., 2012 SLD, TAD, Análise forense e Trimipramin d-3 500 LLE Éter etílico- HPLC MS/MS 5-1000 Maior que
norsildenafila, monitorização SLD d-8 acetato de etila C18 (125,0 × 2,0 mm 475→100 (SLD) 57,0
vardenafila e terapêutica (1:1 v/v) 3,0 μm) (SLD) 5-1000 para todos
norvardenafila Acetonitrila com 483→108 (TAD) analitos
ácido fórmico 0,1% (SLD d-8)
(v/v):formiato de 390→268
amônio 50 mM pH (TAD)
3,5 (gradiente)
CHALLA et al., SLD e N-DMS Estudos de SLD d-8 250 LLE Éter metil-terc- HPLC MS/MS 1–1000 73,45
2010 bioequivalência N-DMS d-8 butílico C18 (75,0 × 4,6 mm, 475→283 (SLD) (SLD)
3,5 μm) (SLD) 0,5–500,0 63,97
Acetonitrila:acetato 483→283 (N-DMS) (N-DMS)
de amônio 10 mM (SLD d-8)
(95:5 v/v) 461→283
(N-DMS)
469→283
(N-DMS d-8)
 111

Tabela 27 – Métodos bioanalíticos para a determinação de SLD e TAD em plasma humano (continuação).
Volume
Preparo Faixa
Padrão(ões) de Solvente/ Recupera-
Referência Analito(s) Aplicação de Cromatografia Detecção validada
interno(s) amostra sorvente ção (%)
amostra (ng/mL)
(µL)
QUINTERO et al., SLD Estudos clínicos Diazepam 460 LLE Éter etílico- HPLC UV 20-1000 92,66-96,94
2009 diclorometano C18 (150,0 × 3,9 mm, 240 nm
(60:40 v/v) 5,0 μm)
Acetonitrila:tampão
acetato de amônio
300 mM pH 6,8 (1:1
v/v)
SHAKYA et al., TAD Estudos clínicos Loratadina 500 LLE Éter etílico- HPLC UV 5-600 66,1±2,8
2007 diclorometano C18 (250,0 × 4,6 mm, 225 nm
(7:3 v/v) 5,0 μm)
Acetonitrila:solução
aquosa contendo
trietilamina 0,012 M
e ácido fosfófico
0,020 M (50:50 v/v)
RAMAKRISHNA TAD Estudos de SLD 250 LLE Éter etílico- HPLC MS/MS 10-1000 65,16 ±
et al., 2004 farmacocinética, diclorometano C18 (100,0 × 3,0 mm, 390→268 1,81
biodisponibilidade (70:30 v/v) 3,5 μm) (TAD)
e bioequivalência Acetonitrila:formiato 475→58
de amônio 10 mM (SLD)
(10:90 v/v, pH 3,0)
SHEU et al., 2003 SLD Estudo de Butilparabeno 1000 LLE Solução HPLC UV 10-1000 Maior que
farmacocinética alcalina C18 (150,0 × 4,6 mm, 230 nm 75,0
5,0 μm)
Acetonitrila:tampão
fosfato de potássio
30 mM pH 6 (55:45
v/v)
Legenda: DMSPE: dispersive magnetic solid phase extraction, HIV: vírus da imunodeficiência humana; HPLC: cromatografia líquida de alta eficiência, LLE:
extração líquido-líquido, MS/MS: espectrometria de massas sequencial, PPT: precipitação de proteínas, SLD: sildenafila, SPE: extração em fase sólida, TAD:
tadalafila, UV: ultravioleta.
 112

Não foi encontrado na literatura método que contemple a determinação simultânea

de SLD, TAD, N-DMS e outros fármacos empregados tanto no tratamento
específico, quanto adjuvante da HAP. Sendo assim, considerou-se relevante o
desenvolvimento e validação de método bioanalítico que possibilite a quantificação
simultânea desses fármacos em plasma humano, para que o mesmo possa ser
empregado para monitorização terapêutica.

3.2 Hipertensão arterial pulmonar (HAP)

A HAP é definida como uma anormalidade circulatória caracterizada por aumento da

resistência vascular na pequena circulação, em geral por meio de mecanismos
mistos, envolvendo vasoconstrição, remodelamento da parede arterial e trombose in
situ (BRASIL, 2014; CALLOU, 2009; ESC, 2016).

Pode ocorrer associada tanto a uma variedade de condições médicas subjacentes,

quanto a uma doença que afeta exclusivamente a circulação pulmonar, sendo
classificada em quatro subgrupos, entre eles a idiopática (não tem etiologia
definida), hereditária, induzida por drogas e toxinas e associada a outras doenças
(doenças do tecido conjuntivo, infecção pelo vírus da imunodeficiência humana,
hipertensão portal, insuficiência cardíaca congênita e esquistossomose pulmonar)
(ESC, 2016).

Apesar da HAP ser uma doença rara, ela se caracteriza por ser uma doença grave e
progressiva, uma vez que o aumento gradual da resistência vascular pulmonar leva
à insuficiência ventricular direita e morte precoce (BRASIL, 2014; ESC, 2016). A taxa
de mortalidade de pacientes tratados é de, aproximadamente, 15% em 1 ano, 33%
em 3 anos e 42% em 5 anos, com sobrevida média de 3,6 anos (THENAPPAN et al.,
2007).

A evolução da HAP depende de uma série de fatores, conhecidos como

complicadores, agravantes ou de progressão. Grande parte desses está relacionada
à extensão e gravidade da disfunção endotelial, a qual se expressa por três eventos
de alta relevância fisiopatológica: vasoconstrição, inflamação e trombose. Dessa
forma, a quase totalidade dos recursos terapêuticos que têm sido desenvolvidos
 113

para o tratamento da HAP tem como alvo um ou mais desses três mecanismos
(SBC, 2005).

3.2.2 Farmacoterapia da HAP

A hipertensão arterial pulmonar é uma síndrome complexa para a qual não existem
esquemas simples de avaliação diagnóstica e orientação terapêutica. A conduta
terapêutica baseia-se nos resultados dos exames clínicos, falha/sucesso terapêutico
e reações adversas apresentadas pelo paciente (SAS/MS, 2014; SBC, 2005).

Na HAP, há um aumento dos mediadores vasoconstritores endotelina-1, tromboxano

A2 e serotonina, e uma diminuição dos mediadores vasodilatadores prostaciclina,
óxido nítrico e peptídeo vasoativo intestinal (VIP, em inglês vasoactive intestinal
peptide). As terapias medicamentosas visam antagonizar os mediadores
vasoconstritores e aumentar a vasodilatação (BARNES, 2012).

Sendo assim, os protocolos clínicos e diretrizes terapêuticas nacional e

internacionais para a HAP incluem medidas/cuidados não medicamentoso (restrição
de sódio na dieta, exercício físico controlado e supervisionado e oxigenoterapia),
tratamento específico e tratamento adjuvante dos fenômenos associados (trombose
in situ, hipoxemia, insuficiência cardíaca direita) (BRASIL, 2014; ESC, 2016;
SAS/MS, 2014).

3.2.2.1 Fármacos específicos para tratamento da HAP

As classes de fármacos utilizados no tratamento específico da HAP incluem

antagonistas de canal de cálcio, inibidores da PDE-5, análogos de prostaciclinas e
antagonistas dos receptores de endotelina.

O uso de fármacos bloqueadores do canal de cálcio, para promover vasodilatação, é

iniciado quando os pacientes apresentam resposta positiva no teste agudo de
vasorreatividade pulmonar, que consiste em um teste hemodinâmico invasivo de
resposta aguda a vasodilatador (adenosina, prostaciclina intravenosa ou óxido
nítrico inalatório). Os bloqueadores de canal de cálcio que têm sido relatados nos
 114

estudos são nifedipino (NIF), diltiazem (DTZ) e anlodipino (ANLO). O tratamento

deve ser iniciado com doses baixas, de modo que as doses iniciais são de 30 mg de
NIF de liberação prolongada duas vezes ao dia ou 60 mg de DTZ três vezes ao dia
ou 2,5 mg de ANLO uma vez ao dia, e deve ser realizado o aumento progressivo da
dose conforme a tolerância do paciente (HOETTE et al., 2010). As doses diárias
desses medicamentos que apresentam eficácia demonstrada na HAP idiopática são
relativamente altas: 120 – 240 mg para NIF, 240 – 720 mg para DTZ e até 20 mg
para ANLO (ESC, 2016).

Uma vez que a vasculatura pulmonar possui quantidades substanciais de PDE-5, o

benefício clínico dos inibidores da PDE-5 na HAP justifica-se pela vasodilatação
pulmonar significativa que provocam pelo aumento na concentração intracelular de
GMPc, um potente vasodilatador e inibidor de proliferação celular (ESC, 2016;
REFFELMANN; KLONER, 2009; WILKINS et al., 2008). Dentre os inibidores da
PDE-5 utilizados, encontram-se o SLD e a TAD.

Segundo estabelecido na Relação Nacional de Medicamentos Essenciais

(RENAME), o SLD está disponível em forma de comprimidos, contendo 20, 25 ou 50
mg. A dose recomendada para o tratamento da HAP é de 60 mg/dia (em três
administrações de 20 mg). Muitos estudos utilizaram doses maiores, sendo a
máxima, em alguns estudos clínicos, de 240 mg/dia (três administrações de 80 mg).
Todos os esquemas demonstraram melhora da capacidade de exercício. As doses
mais altas produziram maior impacto nos parâmetros hemodinâmicos, entretanto
carecem de estudos de segurança de longo prazo (GALIE et al., 2005).

A TAD tem indicação proposta para tratamento de primeira linha para a hipertensão
pulmonar aguda. As apresentações disponíveis no mercado são comprimidos
revestidos com 20 mg de TAD e a dose diária recomendada é de 40 mg (dois
comprimidos), uma vez ao dia (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2013).

A prostaciclina é produzida predominantemente por células endoteliais e induz

vasodilatação potente de todos os leitos vasculares. Além disso, esses compostos
atuam como potentes inibidores da agregação plaquetária e também apresentam
atividades citoptotetoras e antiproliferativas (JONES et al., 1995). Uma vez que
 115

pacientes com HAP possuem desregulação das vias metabólicas da prostaciclina

(GALIÈ; MANES; BRANZI, 2003), os análogos da prostaciclina foram a primeira
classe a ser aprovada para tratamento específico da HAP. Dentre esses, encontra-
se o iloprosta de administração inalatória (HOETTE et al., 2010).

A endotelina-1 (ET-1) é encontrada em maiores quantidades no tecido pulmonar e

no plasma de pacientes com HAP e esclerodermia. Promove vasoconstrição e
proliferação de células musculares lisas da parede vascular pulmonar por meio da
ligação em receptores de endotelina, presentes nas células do músculo liso vascular
pulmonar (RUBIN et al., 2002). HAP está associada a níveis elevados de ET-1 e,
quanto mais elevados esses níveis, maior é a gravidade da doença e menor a
sobrevida dos pacientes (GALIE; MANES; BRANZI, 2004). Dessa forma, os
antagonistas do receptor de endotelina, como ambrisentana e bosentana, bloqueiam
os receptores da endotelina localizado, predominantemente, nas células musculares
lisas vasculares e nos miócitos cardíacos, prevenindo a ativação mediada por
endotelina de sistemas mensageiros secundários, impedindo assim, a
vasoconstrição e proliferação de células musculares lisas (BRASIL, 2014; ESC,
2016).

3.2.2.2 Tratamento medicamentoso adjuvante

Fazem parte do tratamento adjuvante da HAP, fármacos das classes dos

anticoagulantes, diuréticos e digitálicos.

A justificativa da utilização de anticoagulantes orais no tratamento da HAP baseia-se

na elevada prevalência de lesões trombóticas vasculares no exame post-mortem em
pacientes com HAP idiopática. Além disso, a presença de anormalidades nas vias
de coagulação e fibrinolíticas também foram relatadas. Adicionalmente, os pacientes
com HAP apresentam fatores de risco aumentados não específicos para
tromboembolismo venoso, incluindo insuficiência cardíaca e imobilidade (FUSTER et
al., 1984; HOEPER et al., 1998). Anticoagulação oral, com o uso de derivados
cumarínicos (varfarina - VAR), é indicada para HAP com o objetivo de manter o
tempo de protrombina (razão normalizada internacional - RNI) entre 2 e 3 (SAS/MS,
2014).
 116

O uso de diuréticos é recomendado, pois a insuficiência cardíaca direita

descompensada leva à retenção de fluidos, aumento da pressão venosa central,
congestão hepática, ascite e edema periférico (COHN, 2001). Os diuréticos de alça
são os mais potentes, capazes de causar a eliminação de 15% a 25% do sódio
filtrado. Os principais exemplos dessa classe de fármacos são furosemida e
bumetanida (BUM) (RANG et al., 2012).

Foi demonstrado que o uso de digitálicos melhora o débito cardíaco agudamente na

HAP, embora sua eficácia, até o momento, seja desconhecida quando administrado
cronicamente (RICH et al., 1998). A DGX é um glicosídeo cardiotônico, que aumenta
a contratilidade do miocárdio por atividade direta e exerce o mesmo efeito de
inibição do mecanismo de troca de sódio e potássio nas células do sistema nervoso
autônomo, estimulando-as a exercer, por sua vez, atividade cardíaca indireta
(MEDICINANET, 2020).

3.3 Características físico-químicas e farmacocinéticas dos fármacos utilizados

no tratamento da HAP abordados no presente estudo

O presente estudo contempla o desenvolvimento e validação de um método

bioanalítico para quantificação de fármacos específicos para tratamento da HAP,
dentre eles, três bloqueadores de canal de cálcio (ANLO, DTZ e NIF) e dois
inibidores da PDE-5 (SLD e TAD); e fármacos utilizados no tratamento adjuvante,
sendo eles, a VAR, BUM e DGX; além do N-DMS (metabólito do SLD).

Para favorecer e embasar as escolhas e discussões durante o desenvolvimento e

validação do método bioanalítico, realizou-se levantamento das propriedades físico-
químicas e farmacocinéticas dos analitos, as quais são apresentadas nas Tabelas
28 e 29, respectivamente. Além disso, como o método de preparo de amostra
utilizado foi a DLLME, foram obtidos os gráficos de log D (coeficiente de distribuição)
em função do pH dos analitos e possíveis padrões internos (PI), para auxiliar na
seleção e otimização dos parâmetros envolvidos na extração, os quais são
apresentados na Figura 22.
 117

Tabela 28 – Características físico-químicas dos analitos selecionados para desenvolvimento do método bioanalítico.

Massa
Classe Log
Analito Fórmula química Estrutura química exata pKa Solubilidade
farmacológica P
(g/mol)

Pouco solúvel em
água, facilmente
Besilato de C20H25ClN2O5.C6H6O3S 566,1489 solúvel em metanol,
Bloqueador de
anlodipino 9,40 3,00 ligeiramente solúvel
canal de cálcio
(ANLO) C20H25ClN2O5 408,1452 em etanol, pouco
solúvel em 2-
propanol

Pouco solúvel em
Bumetanida Diurético de
C17H20N2O5S 364,1093 2,70 2,60 água, solúvel em
(BUM) alça
soluções alcalinas

Praticamente
insolúvel em água,
facilmente solúvel
Digoxina Glicosídeo
C41H64O14 780,4296 7,15 1,26 em piridina, pouco
(DGX) cardiotônico
solúvel em álcool
diluído e em
clorofórmio
C22H30N6O4S.C6H8O7 666,2319 Pouco solúvel em
Citrato de
Inibidor da água e em metanol,
sildenafila Figura 1A (página 25) 5,99 2,75
PDE-5 praticamente
(SLD)
C22H30N6O4S 474,2049 insolúvel em hexano
Facilmente solúvel
em água,
clorofórmio, ácido
Cloridrato de C22H26N2O4S.HCl 450,1380
Bloqueador de fórmico e metanol,
diltiazem 8,06 2,70
canal de cálcio ligeiramente solúvel
(DTZ) C22H26N2O4S 414,1613
em álcool
desidratado,
insolúvel em éter
 118

Tabela 28 – Características físico-químicas dos analitos selecionados para desenvolvimento do método bioanalítico (continuação).
Massa
Classe Log
Analito Fórmula química Estrutura química exata pKa Solubilidade
farmacológica P
(g/mol)

Praticamente
Nifedipino Bloqueador de insolúvel em água,
C17H18N2O6 346,1165 - 2,20
(NIF) canal de cálcio facilmente solúvel
em acetona

N-desmetil
Metabólito
sildenafila C21H28N6O4S 460,1893 - - -
ativo do SLD
(N-DMS)

Praticamente
insolúvel em água,
Tadalafila Inibidor da facilmente solúvel
C22H19N3O4 Figura 1B (página 25) 389,1376 0,85 1,70
(TAD) PDE-5 em dimetilsulfóxido,
pouco solúvel em
cloreto de metileno

Muito solúvel em
água, facilmente
Varfarina solúvel em etanol,
Anticoagulante C19H15O4 308,1049 5,87 2,70
(VAR) pouco solúvel em
clorofórmio e em
éter

Fonte: PUBCHEM, 2020; THE UNITED, 2019.

 119

Tabela 29 – Características farmacocinéticas dos analitos selecionados para desenvolvimento do método bioanalítico.
Ligação a Formas farmacêuticas
Concentração plasmática máxima - CMÁX Meia-vida t1/2
Analito proteínas Dose diária e dosagens presentes
(ng/mL) (h)
plasmáticas (%) no mercado
Besilato de
(18,10 ± 7,10) Comprimidos
anlodipino (93,0 ± 1,0)1 (39,0 ± 8,0)1 2,5-20 mg4
(após uma dose oral de 10 mg)1 2,5; 5 e 10 mg6
(ANLO)
Bumetanida (106,00 ± 22,00) Comprimidos
(99,0 ± 0,3)1 (0,8 ± 0,2)1 0,5-1 mg5
(BUM) (após uma dose oral de 3 mg)1 0,5; 1 e 2 mg7
0,75-1,50 mg
Comprimidos
(dose de ataque rápido)
0,25 mg
Digoxina (1,40 ± 0,70) 0,25-0,75 mg
(25,0 ± 5,0)1 (39,0 ± 13,0)1
(DGX) (após uma dose oral de 0,31 ± 0,19 mg)1 (dose de ataque lento)
Elixir
0,125-0,250 mg
0,05 mg/mL8
(dose de manutenção)5
Cloridrato de
(151,00 ± 46,00) Comprimidos
diltiazem (78,0 ± 3,0)1 (4,4 ± 1,3)1 60-720 mg4
(após uma única dose oral de 120 mg)1 30, 60, 90, 12 e 180 mg6
(DTZ)
N-desmetil
sildenafila (83,42 ± 45,99)2 e 126,003 - - - -
(N-DMS)
Cápsula mole
10 mg
Liberação imediata: (79,00 ± 44,00)
Comprimidos revestidos
Nifedipino (após uma única dose oral de 10 mg)1
(96,0 ± 1,0)1 (1,8 ± 0,4)1 30-240 mg4 10 e 20 mg
(NIF) Liberação prolongada: (35,00 - 49,00)1
Comprimidos revestidos
(após uma única dose oral de 60 mg)
de liberação prolongada
20, 30 e 60 mg6
Citrato de 60 mg/dia
(212,00 ± 59,00) Comprimidos revestidos
sildenafila 96,01 (2,4 ± 1,0)1 (em três administrações de
(após uma única dose oral de 50 mg)1 20; 25; 50 e 100 mg6
(SLD) 20 mg)4
Tadalafila 378,00 Comprimidos revestidos
94,01 17,51 40 mg5
(TAD) (após uma única dose oral de 20 mg)1 5 e 20 mg6
2,5 mg a 5 mg ao dia, com
ajustes posológicos
Enantiômero R: (900,00 ± 400,00)
baseados nos resultados
Enantiômero S: (500,00 ± 200,00)
Varfarina de RNI. Na maioria dos Comprimidos
(estado de equilíbrio dinâmico médio, 12 (99,0 ± 1,0)1 (37,0 ± 15,0)1
(VAR) pacientes, a resposta é 1; 2; 2,5; 5; 7,5 e 10 mg6
horas após a dose oral diária de 6,1 ± 2,3
satisfatoriamente mantida
mg da forma racêmica)1
com uma dose de 2,5 a 10
mg ao dia5
1BRUNTON; LAZO; PARKER, 2006. 2AL-GHAZAWIA; TUTUNJI; ABURUZ, 2007. 3NICHOLS; MUIRHEAD; HARNESS, 2002. 4ECS, 2016.5ANVISA, 2020a.
6ANVISA, 2020b. 7BUMEX, 2020 (não registrado no Brasil). 8MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2020.
 120

Figura 22 – Gráficos de log D (coeficiente de distribuição) dos analitos em função do pH.

Anlodipino Bumetanida Diltiazem N-desmetil sildenafila

Digoxina

Nifedipino Sildenafila Tadalafila Varfarina

Sildenafila d-8 Verapamil Propranolol Carvedilol Diazepam

Fonte: CHEMAXON, 2020.

 121

4 MATERIAIS

4.1 SQR e IFA

• As seguintes SQR foram utilizadas: bumetanida (Farmacopeia Americana -
USP, lote IOC111, pureza de 100,00%), carvedilol (Farmacopeia Americana -
USP, lote FOG379, pureza de 99,80%), citrato de sildenafila (Farmacopeia
Europeia, lote 1.1, pureza de 98,80%), cloridrato de diltiazem (Farmacopeia
Brasileira, lote 1024, pureza de 100,00%), cloridrato de propranolol
(Farmacopeia Americana - USP, lote I0C170, pureza de 100,00%), diazepam
(Farmacopeia Brasileira, lote 1024, pureza de 100,00%), digoxina
(Farmacopeia Americana - USP, lote N-1, pureza de 100,00%),
hidroclorotiazida (Farmacopeia Americana - USP, lote H, pureza de 100,00%),
nifedipino (Farmacopeia Brasileira, lote 2025, pureza de 99,60%), N-desmetil
sildenafila (Toronto Research Chemicals, lote 2-NOT-111-4, pureza de
98,00%), sildenafila d-8 (Toronto Research Chemicals, lote 2-OMK-8-1,
pureza de 98,00%), tadalafila (Farmacopeia Europeia, lote 2.0, pureza de
99,90%), varfarina (Sigma-Aldrich, lote BCBV7416, pureza de 99,50%),
• Os IFA descritos a seguir também foram usados: besilato de anlodipino
(Purifarma, lote AMB/030/04/17, pureza de 99,75%) e cloridrato de verapamil
(Fagron, lote 16C04-B011-003142, pureza de 100,00%).

4.2 Amostras de plasma humano

Para a obtenção do plasma branco (plasma de voluntários que não estavam fazendo
uso de qualquer medicação), amostras de sangue de voluntários sadios foram
coletadas no Laboratório de Hematologia Clínica da Faculdade de Farmácia da
UFMG. As amostras reais foram obtidas de pacientes voluntários atendidos no
Serviço de Anticoagulação, Hematologia e Oncologia do Hospital das Clínicas da
Universidade Federal de Minas Gerais. Em ambos os casos, o sangue foi coletado
utilizando-se tubos para coleta contendo heparina sódica como anticoagulante.
Imediatamente após a coleta, os tubos, adequadamente identificados com o código
do voluntário, foram centrifugados a 480 x g durante 10 minutos a 4 ºC e, em
seguida, o plasma (sobrenadante) foi separado e transferido para tubos tipo Falcon,
que foram mantidos em freezer à temperatura de 70 ºC negativos. O estudo foi
 122

aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (COEP) da UFMG, protocolos CAAE

65767617.9.0000.5149 e 01455418.4.0000.5149.

4.3 Reagentes
• Água ultrapura.
• Reagentes grau analítico: acetato de amônio e ácido acético glacial Neon
(São Paulo, Brasil), acetona e clorofórmio Dinâmica (Indaiatuba, Brasil),
acetato de amônio e etanol Merck (Darmstadt, Alemanha), ácido cítrico
anidro, diclorometano, hidróxido de amônio e hidróxido de sódio Synth,
(Diadema, Brasil), ácido fórmico, bicarbonato de sódio, citrato de sódio
tribásico di-hidratado, cloreto de sódio, clorobenzeno e 1,2-dicloroetano
Sigma Aldrich (Saint Louis, EUA), ácido trifluoroacético Tedia Company
(Fairfield, USA), etanolamina Carlo Erba (Barcelona, Espanha), formiato de
amônio Spectrum (New Jersey, EUA) e 2-propanol J.T. Baker (Xalostoc,
México).
• Solventes grau HPLC: acetonitrila Merck (Darmstadt, Alemanha), acetonitrila
Tedia Company (Fairfield, USA) e metanol Sigma Aldrich (Saint Louis, EUA).

4.4 Materiais, vidrarias e instrumentos

• Coluna cromatográfica Phenomenex Synergi 4µ Fusion C18 - 80A (50 x 2,0
mm, 4 µm).
• Coluna cromatográfica Phenomenex Synergi 4µ Hydro C18 - 80A (50 x 2,0
mm, 4 µm).
• Coluna cromatográfica Phenomenex Onyx Monolithic C18 (100 x 4,6 mm).
• Frasco tipo vial total recovery com tampa de rosca e septos de silicone.
• Filtros de seringa de PVDF com 0,45 µm de tamanho de poro.
• Kit para filtração a vácuo.
• Membrana de celulose regenerada para filtração com 47 mm de diâmetro e
poros de 0,45 µm Sartorius Stedim Biotech.
• Microtubos de 1,5 mL e 2,0 mL.
• Pipetas automáticas.
• Ponteiras para uso em pipetas automáticas.
• Seringas de insulina de 1 mL.
 123

• Tubos criogênicos de 2,0 mL e 5,0 mL.

• Tubos de fundo cônico tipo Falcon de 15 mL e 50 mL.
• Tubos para coleta de plasma de 9 mL contendo heparina sódica.

4.5 Equipamentos
• Agitador tipo vórtex VELP SCIENTIFICA F202A0175.
• Aparelho de ultrassom BRANSON 3210R-MT.
• Aparelho de ultrassom UNIQUE USC750.
• Balança analítica SARTORIUS BP211D.
• Balança semi-analítica Ohaus TP2KS
• Bomba de vácuo Weg B480794.
• Centrífuga Eppendorf 5424 R
• Centrífuga JOUAN MR 23i.
• Concentrador de amostras TECNAL TecVap TE-0194
• Sistema HPLC-MS/MS composto por cromatógrafo a líquido de alta eficiência
Agilent 1200 Series (equipado com desgaseificador, bomba binária, forno de
colunas, injetor automático e amostrador com refrigeração) acoplado a
espectrômetro de massas SCIEX QTRAP 5500 (equipado com bomba de
infusão, fonte de ionização electrospray e analisador do tipo híbrido -
quadrupolo e íon trap) e software Analyst.
• Potenciômetro METROHM 827 pH Lab.
• Sistema de purificação de água MILLIPORE DIRECT Q3.
• Softwares Design Expert®, Microsoft Excel® e MultiQuant®.
 124

5 MÉTODOS

5.1 Desenvolvimento do método bioanalítico

Com o objetivo de desenvolver método para quantificação simultânea de SLD, N-

DMS, TAD e outros fármacos empregados no tratamento da HAP (ANLO, BUM,
DGX, DTZ, NIF e VAR) em plasma humano, empregou-se a DLLME na etapa de
preparo de amostra, seguida pela análise por HPLC-MS/MS, com ionização por
electrospray e analisador do tipo triplo quadrupolo.

As etapas envolvidas no desenvolvimento do método bioanalítico consistiram,

sequencialmente, na determinação dos parâmetros espectrométricos,
cromatográficos e de preparo de amostra. Para a quantificação dos analitos foram
utilizados dois padrões internos (PI), os quais foram escolhidos conforme descrito no
item 6.1.4 (página 171). Para o SLD, o PI utilizado foi o isótopo deuterado do
sildenafila (SLD d-8, C22H22D8N6O4S), que possui massa exata de 482,2551 g/mol.
Os demais analitos foram quantificados utilizando-se o verapamil (VERA,
C27H38N2O4), que possui massa exata de 454,2831 g/mol como PI. As estruturas
químicas dos PI são apresentadas na Figura 23.

Figura 23 – Estruturas químicas dos PI utilizados para quantificação: SLD d-8 (A) e VERA (B).

(A) (B)
Fonte: adaptado de PUBCHEM, 2020.

5.1.1 Determinação dos parâmetros espectrométricos

Iniciou-se o desenvolvimento do método bioanalítico otimizando-se os parâmetros

espectrométricos necessários para a detecção dos analitos. Para isso,
 125

primeiramente, prepararam-se soluções padrão estoque individuais dos analitos e PI

a 0,1 mg/mL em metanol. Essas soluções padrão estoque foram diluídas, utilizando-
se mistura de metanol e água ultrapura 50:50 (v/v), acidificada com ácido fórmico a
0,1% (v/v) como solvente, resultando em uma solução mistura contendo 50 ng/mL
de cada um dos analitos. O preparo foi feito conforme preconizado no manual do
operador do espectrômetro de massas SCIEX Triple Quad e QTRAP® (SCIEX,
MN.ST.004 rev.02).

Em seguida, foi realizado o procedimento de infusão direta da solução mistura no

espectrômetro de massas, utilizando-se vazão de infusão de 10 L/min, posições
dos sprays vertical e horizontal ajustadas em 10 e 5, respectivamente. Nessa etapa,
foram definidos o modo de ionização (positivo ou negativo), os valores de potencial
de desagregação, em inglês declustering potential (DP), a energia de colisão, em
inglês collision energy (CE), o potencial de saída da célula, em inglês collision cell
exit potencial (CXP) e as transições de massas de quantificação e de confirmação a
serem monitoradas (íon precursor → íon produto), para cada analito. O potencial de
entrada, em inglês entrance potential (EP) foi mantido em 10 V.

O próximo passo consistiu na otimização dos parâmetros da fonte de ionização,

sendo eles: voltagem do capilar, nível do gás de colisão, gás de contra-corrente, em
inglês curtain gas, temperatura e, por fim, pressão dos gases de nebulização (GS1)
e de secagem (GS2). Essa etapa da otimização foi realizada no modo de análise por
injeção de fluxo (FIA, em inglês flow injection analysis), no qual utilizou-se o
cromatógrafo (sem coluna) para injetar no espectrômetro de massas 20 µL de uma
solução do analito que apresentou menor intensidade de ionização, a DGX. Para
isso, preparou-se uma solução de DGX a 10 ng/mL em metanol e água 50:50 (v/v).
A fase móvel foi constituída por solução aquosa de ácido fórmico 0,1% (v/v) e
metanol com ácido fórmico 0,1% (v/v) a uma vazão de 0,5 mL/min. O tempo de cada
corrida foi de 0,7 minutos, o gás de colisão utilizado foi o nitrogênio e as posições
dos sprays vertical e horizontal foram ajustadas em 5 e 2, respectivamente. Os
valores testados durante a otimização dos parâmetros da fonte encontram-se na
Tabela 30.
 126

Tabela 30 – Valores testados para os respectivos parâmetros durante a otimização da fonte de

ionização.
Parâmetro Valores
Voltagem do capilar (V) 4000, 4500, 5000 e 5500
Gás de colisão (nível) Baixo, médio e alto
Curtain gas (psi) 10, 12, 15 e 20
Temperatura da fonte (ºC) 450, 500, 550, 600, 650
GS1/nebulização (psi) 40, 45 e 50
GS2/secagem (psi) 40, 45 e 50

5.1.2 Otimização das condições cromatográficas

Para os testes de otimização das condições cromatográficas foi utilizada uma

solução mistura dos analitos a 100 ng/mL preparada em acetonitrila e água 10:90
(v/v).

Iniciou-se o desenvolvimento do método cromatográfico otimizando-se a composição

da fase móvel. Como o método envolve a análise simultânea de 11 analitos que
apresentam características físico-químicas distintas, utilizou-se o método de eluição
em gradiente. Para a definição do eluente aquoso foram testados, como aditivos,
ácido fórmico, acetato de amônio e formiato de amônio, em várias concentrações e
diferentes ajustes de pH. Quanto ao eluente orgânico, testaram-se acetonitrila e
metanol. Os testes foram realizados empregando-se coluna Phenomenex Synergi
Fusion C18 (50 x 2,0 mm, 4 µm), vazão de 0,5 mL/min, volume de injeção de 5 µL e
um gradiente inicial amplo, apresentado na Tabela 31.

Tabela 31 – Gradiente utilizado durante etapa inicial de desenvolvimento do método.

Tempo A% (v/v) B% (v/v)
Eluição
(min) (eluente aquoso) (eluente orgânico)
0 – 10 80%→ 0% 20% → 100% Gradiente linear
10 – 11 0%→ 80% 100% → 20% Gradiente linear
11 – 15 80% 20% Re-equilíbrio

A fase móvel escolhida foi aquela que proporcionou maiores valores de razão
sinal/ruído para os analitos e foi constituída por solução aquosa de ácido fórmico
0,1% (v/v) e acetonitrila.

Em seguida foram testadas colunas cromatográficas que se diferenciavam pela

composição (particuladas e monolítica) e dimensões. Optou-se por utilizar a coluna
 127

que provocou menor efeito residual e melhor aspecto dos picos cromatográficos
(formato gaussiano e precisão de injeção).

O próximo passo consistiu em otimizar o gradiente e, para isso, foram propostas

diversas alterações no tempo e proporção do solvente orgânico, com a finalidade de
obter um fator de retenção superior a 1,5 (tentativa de reduzir a possibilidade de
efeito matriz) e menor tempo de corrida. O tempo para re-equilíbrio da coluna foi
estabelecido com base na avaliação dos DPR dos tempos de retenção dos analitos
após cinco injeções consecutivas da solução mistura dos analitos a 100 ng/mL.

As condições cromatográficas e o gradiente do método otimizados, utilizando-se

HPLC-MS/MS para análise simultânea dos nove analitos (ANLO, BUM, DGX, DTZ,
N-DMS, NIF, SLD, TAD e VAR) e dos dois PI (SLD d-8 e VERA), encontram-se
descritas nas Tabelas 32 e 33, respectivamente.

Tabela 32 – Resumo das condições cromatográficas definitivas do método bioanalítico por

HPLC-MS/MS.
Parâmetros Condições
Coluna Phenomenex®, Onyx Monolithic C18 (100 x 4,6 mm)
Eluente aquoso Solução aquosa de ácido fórmico 0,1% (v/v)
Eluente orgânico Acetonitrila
Vazão da fase móvel 0,5 mL/min
Gradiente Descrito na Tabela 31
Temperatura do forno 30 °C
Volume de injeção 5 µL
Tempo de corrida 7 min seguidos de 5 min para re-equilíbrio da coluna

Tabela 33 – Gradiente definitivo do método bioanalítico por HPLC-MS/MS.

A% (v/v)
Tempo B% (v/v)
(solução aquosa de ácido Eluição
(min) (acetonitrila)
fórmico 0,1% (v/v))
0 – 2,0 70%→ 5% 30% → 95% Gradiente linear
2,0 – 6,5 5% 95% Isocrática
6,5 – 7,0 5% → 70% 95% → 30% Gradiente linear
7,0 – 12,0 70% 30% Re-equilíbrio

A última etapa da otimização do método cromatográfico consistiu na definição dos

valores de Dwell Time para cada transição de massas monitorada, utilizando-se a
equação disponível no manual do operador do espectrômetro de massas SCIEX
Triple Quad e QTRAP® (SCIEX, MN.ST.004 rev.02), apresentada a seguir:
 128

Como o SLD, o N-DMS e o SLD d-8 apresentam íons produtos em comum, realizou-
se teste para avaliar a ocorrência do fenômeno de crosstalk. Para isso, foram
utilizadas uma solução branco (contendo apenas o diluente) e uma contendo SLD a
100 ng/mL em diluente. Essas soluções foram analisadas por um método que
monitorava todas as transições de quantificação e confirmação correspondentes aos
analitos N-DMS, SLD e SLD d-8. Para confirmar a ausência de crosstalk, espera-se
que os sinais referentes às transições dos analitos ausentes na solução (N-DMS e
SLD d-8) sejam iguais ao ruído de fundo obtido com a solução branco.

5.1.3 Otimização da etapa de preparo de amostra

Os testes para otimização da etapa de preparo de amostra foram realizados a partir

de amostras de plasma branco fortificadas com os analitos a 50 ng/mL. Inicialmente,
o PI utilizado foi SLD d-8 em solução metanólica a 250 ng/mL.

Com o objetivo de aumentar a eficiência da extração e a recuperação dos analitos,

optou-se pela realização de uma etapa prévia de limpeza da amostra por PPT. O
sobrenadante obtido nessa etapa agiu como dispersante para a técnica DLLME.

Para a definição do solvente precipitante, realizou-se um experimento univariado, no

qual foram testados nove diferentes agentes precipitantes, sendo eles: acetona,
acetonitrila e metanol puros, com adição de ácido fórmico 0,1% (v/v) ou hidróxido de
amônio 0,1% (v/v).

O teste foi feito em triplicata e, para o preparo de cada amostra partiu-se de 50 µL

de plasma (contendo 50 ng/mL de cada um dos analitos) em microtubo de plástico
de 1,5 mL. Em seguida, adicionaram-se 20 µL da solução contendo o PI e agitou-se
em vórtex por 15 segundos. Acrescentaram-se 100 µL do solvente precipitante e
homogeneizou-se em agitador do tipo vórtex por 60 segundos. Centrifugou-se a
amostra durante 5 minutos a 9400 x g e 4 °C, retirou-se o sobrenadante e transferiu-
 129

se para outro microtubo de 1,5 mL. Evaporou-se o solvente em concentrador de

amostras, ressuspenderam-se os analitos em 50 µL de fase móvel (mistura de
acetonitrila e solução aquosa de ácido fórmico 0,1% v/v na proporção de 30:70 v/v),
agitou-se em vórtex por 30 segundos e transferiu-se para vial. Após análise das
amostras pelo método por HPLC-MS/MS otimizado, investigaram-se os resultados
por ANOVA (testes F e Tukey). A escolha do agente precipitante foi baseada nos
valores de área média sob o pico dos analitos.

A otimização das variáveis quantitativas referentes à etapa de PPT, foi realizada por
um planejamento composto central (CCD, em inglês central composite design). As
variáveis independentes escolhidas para compor o planejamento foram: volume da
amostra (X1), proporção entre volume do solvente precipitante e volume da amostra
(X2) e tempo de agitação (X3). Os níveis avaliados são apresentados na Tabela 34.

Tabela 34 – Variáveis e seus níveis empregadas para a otimização da etapa de PPT.

Níveis
Variável (Xi)
-1 0 +1
Volume da amostra (µL) (X1) 50 75 100
VSP / Vamostra (X2) 2 3 4
Tempo de agitação (s) (X3) 30 45 60
Legenda: SP = Solução precipitante - acetonitrila com hidróxido de amônio 0,1% (v/v); V = volume.

As amostras foram preparadas de maneira a reproduzir a matriz experimental do

CCD, com três pontos centrais, totalizando 11 experimentos, os quais foram
realizados de maneira aleatória. As variáveis dependentes (respostas) avaliadas
foram as recuperações dos analitos obtidas em cada experimento, utilizando-se a
seguinte equação:

Recuperação (%) = (concentração experimental / concentração teórica) x 100

A concentração teórica foi determinada por meio do preparo de amostra partindo de

diferentes volumes de plasma branco (50, 75 e 100 µL), utilização do dobro de
solvente precipitante e 30 segundos de agitação. A ressuspensão foi feita com
soluções nas concentrações teóricas finais dos analitos.
 130

Os resultados de recuperação obtidos foram analisados utilizando-se software

Design Expert®. Então, os modelos matemáticos gerados para cada analito foram
avaliados por ANOVA e, aqueles analitos cujos modelos apresentaram regressão
significativa (p<0,05) e não apresentaram falta de ajuste (p>0,05), foram os
selecionados para determinação da desejabilidade. Dessa forma, foi possível
estabelecer as condições ótimas para a etapa de precipitação de proteínas.

Posteriormente, otimizou-se, de forma sequencial e univariada, os parâmetros que

influenciam na DLLME, sendo eles: pH, concentração, força iônica e volume da fase
aquosa, tipo e volume de solvente extrator, tipo e volume de solvente dispersante e
tempo de agitação.

Durante esses testes, as amostras foram preparadas em triplicata da seguinte

maneira: pipetaram-se 100 µL da amostra de plasma (fortificado com 50 ng/mL dos
analitos), que foram transferidos para microtubo de plástico de 1,5 mL. Adicionaram-
se 40 µL de solução de PI e agitou-se em vórtex por 15 segundos. Acrescentou-se o
volume do solvente dispersante correspondente e homogeneizou-se em agitador do
tipo vórtex por 30 segundos. Centrifugou-se a amostra durante 5 minutos a 9400 x g
e 4 °C e transferiu-se o sobrenadante para outro microtubo de 1,5 mL. Adicionou-se
volume correspondente do solvente extrator ao microtubo contendo o sobrenadante
da etapa de PPT. Aspirou-se o conteúdo desse microtubo com uma seringa de 1 mL
e o mesmo foi adicionado rapidamente em um microtubo de 2 mL contendo o
tampão correspondente. Agitou-se em vórtex por tempo correspondente,
centrifugou-se por 5 minutos a 9400 x g e 4 °C e aspirou-se o sedimento (fase
extratora, situada na parte inferior do microtubo) com a mesma seringa de 1 mL.
Transferiu-se para um microtubo de plástico de 1,5 mL e evaporou-se o solvente em
concentrador de amostras. Ressuspendeu-se os analitos com 50 µL de fase móvel,
agitou-se em vórtex durante 30 segundos, transferiu-se para vial e injetou-se no
sistema HPLC-MS/MS.

Os resultados de área média sob os picos obtida para cada analito foi plotada em
gráficos em função da condição avaliada. A escolha da melhor condição foi realizada
por meio da análise desses gráficos, priorizando-se a condição que proporcionou
maior área sob o pico dos analitos.
 131

Por fim, os PI a serem utilizados no método bioanalítico foram escolhidos por meio
da realização do preparo de amostra em quintuplicata, utilizando-se uma mistura
contendo cinco potenciais PI (SLD d-8, VERA, propranolol, carvedilol e diazepam). O
teste foi realizado em quintuplicata e os PI definidos foram aqueles que
proporcionaram menores valores de DPR entre as áreas dos analitos.

5.2 Validação do método bioanalítico

O método bioanalítico desenvolvido foi validado de acordo com as recomendações

presentes na Resolução RDC nº 27 de 17 de maio de 2012 (ANVISA) (BRASIL,
2012), no Guia de Validação de Métodos Bioanalíticos da European Medicines
Agency (EMA) – Guideline on bioanalytical method validation (EMA, 2011) e no Guia
proveniente do FDA - Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry (FDA,
2018). Foram avaliados os parâmetros seletividade, efeito residual, efeito matriz,
linearidade da faixa de trabalho, precisão, exatidão, recuperação e estabilidade dos
analitos. Os cálculos foram procedidos com auxílio dos softwares Microsoft Excel® e
MultiQuant®.

Antes de iniciar a validação, prepararam-se soluções estoque dos analitos em

metanol e, a partir dessas, foram produzidas soluções de concentrações
intermediárias, utilizando-se também metanol como solvente, para serem
adicionadas ao plasma branco, de modo a obter as concentrações necessárias para
a construção da curva de calibração em plasma e dos controles de qualidade.
Separadamente, foi preparada uma solução metanólica contendo os padrões
internos (VERA a 52,5 ng/mL e SLD d-8 a 250 ng/mL). O volume de solução
metanólica adicionado foi de, no máximo, 5% do volume de plasma utilizado, com o
objetivo de minimizar alterações da matriz biológica.

5.2.1 Seletividade

A seletividade do método bioanalítico foi verificada analisando-se seis amostras

provenientes de fontes distintas, sendo quatro amostras de plasma normal, uma
amostra de plasma hemolisado e uma amostra de plasma lipêmico (proveniente de
coleta pós prandial), todas sem adição de analito e PI.
 132

Os cromatogramas obtidos com essas amostras de plasma branco foram

comparados com aqueles provenientes das amostras extraídas na concentração do
limite inferior de quantificação (LIQ). A presença de picos interferentes próximo ao
tempo de retenção dos analitos foi aceita apenas quando apresentavam área inferior
a 20% da resposta do analito nas amostras do LIQ. Quanto aos PI, as respostas dos
picos interferentes deveriam ser inferiores a 5% da resposta dos PI nas respectivas
concentrações de trabalho.

5.2.2 Efeito residual

Para a avaliação do efeito residual foram preparadas uma amostra de plasma

branco, uma amostra de plasma contendo os fármacos na concentração do limite
superior de quantificação (LSQ) e uma amostra contendo os fármacos na
concentração do LIQ.

Posteriormente, foi injetado no cromatógrafo a amostra branco, seguida pela injeção

da amostra de LSQ e, em sequência injetou-se duas vezes a amostra branco
novamente. Por fim, a amostra de LIQ foi injetada. As áreas sob os picos dos
cromatogramas das amostras de plasma branco foram comparadas com aquelas
obtidas a partir de amostras extraídas de LIQ.

Para que o efeito residual não comprometa a precisão e exatidão do método, a

presença de interferentes nos tempos de retenção dos analitos de interesse só é
aceita quando a área sob os picos interferentes é inferior a 20% das áreas dos
analitos no LIQ e a 5% das áreas dos PI.

5.2.3 Efeito matriz

A avaliação do efeito matriz foi realizada para o procedimento de preparo de

amostra otimizado por DLLME e também para a etapa que compreende apenas o
preparo de amostra por PPT. Em ambas as análises foram utilizadas oito amostras
de plasma branco de voluntários diferentes, sendo quatro de plasma normal, duas
de plasma hemolisado e duas de plasma lipêmico.
 133

Foi necessário primeiramente preparar soluções contendo os analitos e PI em

diluente constituído por mistura de acetonitrila e água (30:70 v/v) nas concentrações
referentes ao controle de qualidade de baixa concentração (CQB) e controle de
qualidade de alta concentração (CQA). Parte dessas soluções foi transferida para
vial e outra parte foi utilizada para a ressuspensão das amostras de plasma branco,
conforme descrito a seguir.

O efeito matriz do procedimento de preparo de amostra por DLLME, foi avaliado

utilizando-se 100 μL de cada amostra de plasma branco e adicionando-se, em
seguida, 40 μL de metanol. A extração de cada amostra prosseguiu-se conforme o
método otimizado (item 6.1.4, página 171). Após evaporação em concentrador de
amostras, ressuspenderam-se o resíduo com as soluções contendo os analitos e PI
nas concentrações do CQB e do CQA, separadamente, e transferiu-se para vials.

Na avaliação do efeito matriz do procedimento de preparo de amostra por PPT, a

100 μL de cada amostra de plasma branco, adicionaram-se 40 μL de metanol e
agitou-se em vórtex por 15 segundos. Em seguida adicionaram-se 200 μL de
acetonitrila com hidróxido de amônio 0,1% (v/v) e homogeneizou-se em vórtex por
30 segundos. As amostras foram então centrifugadas durante 5 minutos a 9400 x g
e 4 ºC. O sobrenadante foi transferido para um microtubo de 1,5 mL e evaporado em
concentrador de amostras. Após evaporação em concentrador de amostras,
adicionaram-se 50 μL das soluções contendo os analitos e PI nas concentrações do
CQB e do CQA, separadamente. Agitou-se em vórtex durante 30 segundos e
transferiu-se para vials.

As soluções de CQB e CQA, assim como as amostras provenientes das extrações

dos plasmas brancos (por DLLME e por PPT), foram injetadas no sistema HPLC-
MS/MS. Para cada uma das amostras foi obtido o fator de matriz normalizado por PI
(FMN), conforme a seguinte equação:
 134

Em seguida, determinou-se o DPR ou coeficiente de variação (CV) dos FMNs

referentes a todas as oito amostras. O valor obtido para os DPR deve ser inferior a
15% para todos os analitos nos dois níveis de concentração avaliados.

5.2.4 Linearidade

A linearidade do método foi avaliada por meio da construção de três curvas de

calibração contendo oito concentrações distintas dos analitos em três dias diferentes
de análise. Em cada um dos dias, foram realizadas extrações de duas amostras
branco (plasma branco sem adição dos PI), duas amostras zero (plasma branco com
a adição dos PI na concentração de trabalho) e duas amostras de cada um dos oito
níveis de concentração dos analitos. Adicionalmente, para verificação da precisão e
exatidão do método, foram extraídas amostras, em quintuplicata, referentes aos
controles de qualidade: controle de qualidade do limite inferior de quantificação
(CQLIQ), CQB (correspondente a três vezes a concentração do LIQ), controle de
qualidade de média concentração (CQM, correspondente a concentração média
entre o LIQ e LSQ), CQA (correspondente a 80% do LSQ) e controle de qualidade
de diluição (CQD, correspondendo a concentração acima do LSQ). No presente
estudo, o CQD foi diluído na proporção de 1:4 por meio da adição de plasma branco.

Os níveis de concentração para a construção da curva de calibração, bem como dos

controles de qualidade enriquecidos, são apresentados na Tabela 35.

Tabela 35 – Concentrações dos analitos nas amostras de plasma enriquecidas para avaliação
da linearidade, precisão e exatidão do método.
Concentração em plasma (ng/mL)
Amostra
ANLO BUM DGX DTZ N-DMS NIF SLD TAD VAR
Nível 1 / LIQ 1,0 5,0 0,7 5,0 1,0 5,0 5,0 5,0 25,0
Nível 2 2,5 10,0 1,0 10,0 5,0 10,0 10,0 10,0 50,0
Nível 3 5,0 25,0 2,5 50,0 10,0 25,0 50,0 50,0 75,0
Nível 4 10,0 50,0 5,0 100,0 25,0 50,0 100,0 100,0 100,0
Nível 5 25,0 75,0 7,5 250,0 50,0 75,0 250,0 250,0 250,0
Nível 6 50,0 100,0 10,0 500,0 100,0 100,0 500,0 500,0 500,0
Nível 7 75,0 250,0 25,0 750,0 250,0 250,0 750,0 750,0 750,0
Nível 8 / LSQ 100,0 500,0 30,0 1000,0 500,0 500,0 1000,0 1000,0 1000,0
CQB 3,0 15,0 2,1 15,0 3,0 15,0 15,0 15,0 75,0
CQM 50,0 250,0 15,0 500,0 250,0 250,0 500,0 500,0 500,0
CQA 80,0 400,0 24,0 800,0 400,0 400,0 800,0 800,0 800,0
CQD - - - 1500,0 - - - - 3000,0
Legenda: LIQ: limite inferior de quantificação; LSQ: limite superior de quantificação; CQB: controle de
qualidade de baixa concentração; CQM: controle de qualidade de média concentração; CQA: controle de
qualidade de alta concentração; CQD: controle de qualidade de diluição.
 135

A concentração de cada ponto da curva foi calculada considerando a razão entre a

área dos analitos e a área dos respectivos PI, ou seja, as áreas sob os picos de
ANLO, BUM, DGX, DTZ, N-DMS, NIF, TAD e VAR foram normalizadas pela área de
VERA e as áreas sob o pico de SLD foi normalizada pela área de SLD d-8.
Construíram-se, então, as três curvas de calibração, priorizando-se o modelo
matemático mais simples e o fator de ponderação com o menor valor para a soma
dos erros relativos das concentrações nominais versus os valores calculados pela
equação da curva, quando a variância do erro não foi constante em toda a faixa de
trabalho.

Para a avaliação da curva de calibração, foram considerados os desvios das

concentrações calculadas em relação às concentrações nominais para cada ponto.
O desvio máximo permitido para os padrões do LIQ foi de 20% e, para os demais
níveis de concentração foi de 15%. A curva de calibração deve possuir, no mínimo,
75% dos pontos com desvios inferiores aos descritos e seis padrões de
concentrações diferentes, incluindo o LIQ e o LSQ em conformidade com os desvios
permitidos.

5.2.5 Precisão e exatidão

A precisão e exatidão intracorrida (em uma mesma corrida) e intercorridas (em três
dias de análise) foram avaliadas simultaneamente à determinação da linearidade da
faixa de trabalho, por meio da análise de amostras de plasma em cinco
concentrações referentes ao LIQ, CQB, CQM, CQA e CQD, em quintuplicata, após a
injeção das amostras da curva de calibração.

A precisão foi determinada por meio do cálculo do DPR, com base em todos os
valores obtidos. Os valores de DPR devem ser menores que 15%, exceto para o
CQLIQ, para o qual são admitidos valores menores ou iguais a 20%.

A exatidão foi expressa pelo erro padrão relativo (EPR), com base em todos os
valores obtidos, conforme a seguinte equação:
 136

São aceitáveis valores de EPR na faixa de ± 20% do valor nominal para o CQLIQ e ±
15% para as demais amostras de controle de qualidade (CQ).

5.2.6 Recuperação

Para a verificação da recuperação, a qual é recomendada apenas no Guia

proveniente do FDA - Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry (FDA,
2018), primeiramente prepararam-se soluções contendo os analitos e PI em diluente
constituído por mistura de acetonitrila e água (30:70 v/v) nas concentrações de CQB,
CQM e CQA.

Em seguida, extraíram-se amostras de plasma branco e, ao final ressuspendeu-se o

resíduo com as soluções contendo os analitos e PI nas concentrações referentes a
CQB, CQM e CQA separadamente, de maneira a obter quintuplicata de cada
concentração. Esse preparo representa 100% de recuperação. Então comparou-se
com as áreas das amostras dos CQs extraídas e analisadas no mesmo dia.

Não é exigido que a recuperação seja de 100%, mas a extensão da recuperação de

um analito e dos PI deve ser constante e precisa (FDA, 2018).

5.2.7 Estabilidade dos analitos em plasma humano

Avaliou-se a estabilidade dos analitos por meio dos estudos de estabilidade após
ciclos de congelamento e descongelamento (ECC), estabilidade de curta duração
(ECD), estabilidade de longa duração (ELD) e estabilidade pós-processamento
(EPP), levando-se em consideração o tempo necessário para o armazenamento,
preparo e análise das amostras em estudo, assim como as temperaturas de
armazenamento utilizadas.

Determinaram-se o EPR e o DPR para as amostras de estabilidade. Os desvios

entre as concentrações obtidas nas amostras de estabilidade devem ser inferiores a
 137

15%, quando essas amostras forem comparadas com o valor de concentração

nominal.

Para o estudo da ECC, as amostras de plasma branco fortificado com os analitos

nas concentrações de CQB e CQA foram inicialmente congeladas em ultrafreezer a
-70 ºC (mesma temperatura utilizada no armazenamento das amostras reais). Após
24 h essas amostras foram mantidas à temperatura ambiente até que se
encontrassem completamente descongeladas. Em seguida, foram novamente
transferidas para ultrafreezer a 70 ºC negativos, onde permaneceram por 24 h. Os
ciclos de descongelamento e congelamento sucederam-se até que foram
completados três ciclos, quando então, as amostras foram extraídas e analisadas.

As amostras do estudo de ECD foram mantidas em temperatura ambiente durante

quatro horas antes de serem extraídas e analisadas, período de tempo superior ao
que as amostras poderiam ser mantidas nas mesmas condições antes do início do
preparo de amostra.

Para verificar a ELD, as amostras foram processadas e analisadas após serem

armazenadas em ultrafreezer a 70 ºC negativos por 30 dias.

A EPP foi demonstrada por meio da re-análise de amostras previamente analisadas,

armazenadas no amostrador automático do cromatógrafo a 6 ºC durante 30 horas,
para simular o intervalo de tempo compreendido entre o término de preparo das
amostras e o final da corrida analítica mais longa.

5.3 Análise de amostras reais

O método foi aplicado para a determinação da concentração plasmática dos

fármacos presentes nas amostras de 10 pacientes voluntários, pertencentes a um
grupo que recebia atendimento no Serviço de Anticoagulação, Hematologia e
Oncologia do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais. A
análise das amostras provenientes de cada voluntário foi feita em triplicata, seguindo
o método bioanalítico desenvolvido, otimizado e validado.
 138

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO

6.1 Desenvolvimento do método bioanalítico

6.1.1 Determinação dos parâmetros espectrométricos

A primeira etapa da otimização consistiu em obter os espectros de varredura dos

íons precursores e comparar as intensidades dos sinais desses íons obtidos nos
modos positivo e negativo de ionização. O modo positivo de ionização normalmente
é utilizado para análise de substâncias que possuem grupos funcionais básicos
(aminas, amidas e ésteres), devido à facilidade de protonação, enquanto que
substâncias contendo funções ácidas (ácidos carboxílicos e fenóis), são analisadas
geralmente no modo negativo, por serem mais facilmente desprotonadas. Dessa
forma, conforme o esperado, uma vez que os analitos de interesse possuem
grupamentos básicos em suas estruturas, as intensidades dos sinais dos íons
precursores, no modo positivo de ionização, foram superiores às intensidades dos
íons precursores no modo negativo. Assim, para garantir maior detectabilidade ao
método, optou-se por utilizar o modo positivo de ionização (ESI(+)).

Os íons precursores provenientes da ionização no modo positivo foram

fragmentados, gerando assim os íons produto. A partir dos resultados obtidos, foram
escolhidas as transições de massas de quantificação e de confirmação para cada
analito, que estão apresentadas na Tabela 36.

Encontram-se também na Tabela 36, os valores otimizados de DP, CE e CXP, os

quais foram determinados de forma automatizada pelo espectrômetro de massas e
seu software Analyst, a partir da infusão direta de uma solução mistura contendo
todos os analitos na concentração de 50 ng/mL.
 139

Tabela 36 – Transições de massas monitoradas e valores de Dwell Time, DP, CE e CXP

otimizados.
Massa Transições de massas de
Dwell CXP
Analito exata quantificação (Q) e DP (V) CE (V)
Time (ms) (V)
(g/mol) confirmação (C)
409 → 238 (Q) 15 10
ANLO 408,1452 63 66
409 → 294 (C) 13 10

365 → 240 (Q) 23 14

BUM 364,1093 86 65
365 → 284 (C) 19 12

781 → 651 (Q) 15 24

DGX 780,4296 63 67
781 → 391 (C) 23 16

415 → 310 (Q) 29 18

DTZ 414,1613 58 64
415 → 370 (C) 35 18

461 → 283 (Q) 49 12

N-DMS 460,1893 76 80
461 → 85 (C) 47 10

347 → 315 (Q) 11 16

NIF 346,1165 82 56
347 → 254 (C) 25 14

475 → 283 (Q) 51 16

SLD 474,2049 71 71
475 → 100 (C) 37 16

390 → 268 (Q) 19 12

TAD 389,1376 80 66
390 → 169 (C) 75 12

309 → 163 (Q) 21 10

VAR 308,1049 86 77
309 → 251 (C) 27 8

483 → 62 (Q) 99 10
SLD d-8 482,2551 71 45
483 → 108 (C) 37 16

455 → 165 (Q) 37 14

VERA 454,2831 76 141
455 → 150 (C) 45 16

As transições de massas de quantificação e confirmação escolhidas foram aquelas

que proporcionaram sinais analíticos de maior intensidade. Entretanto, no caso do
DTZ, foi necessário escolher transições de massas menos intensas, para que se
conseguisse alcançar o limite superior de quantificação (LSQ) adequado, sem que
ocorresse saturação do detector. Os espectros de massas de fragmentação obtidos
para todos os analitos são apresentados nas Figuras 24 a 34. Foram mostradas as
estruturas químicas ou fragmentações para formação dos íons produto monitorados
(ACEÑA et al., 2014; EICHHORN et al., 2012; GRATZ; GAMBLE; FLURER, 2006;
NIESSEN, 2011; HANDA; SINGH; SINGH, 2014; JAHN et al., 2011; LI et al., 2010;
RAVI et al., 2020; REGALADO et al., 2013; SANZ-NEBOT et al., 2001).
 140

Figura 24 - Espectro obtido após fragmentação do íon precursor m/z 409, proveniente da
ionização no modo positivo do anlodipino (ANLO).

Figura 25 - Espectro obtido após fragmentação do íon precursor m/z 365, proveniente da
ionização no modo positivo da bumetanida (BUM).
 141

Figura 26 - Espectro obtido após fragmentação do íon precursor m/z 781, proveniente da
ionização no modo positivo da digoxina (DGX).

Figura 27 - Espectro obtido após fragmentação do íon precursor m/z 415, proveniente da
ionização no modo positivo do diltiazem (DTZ).
 142

Figura 28 - Espectro obtido após fragmentação do íon precursor m/z 461, proveniente da
ionização no modo positivo do N-desmetil sildenafila (N-DMS).

Figura 29 - Espectro obtido após fragmentação do íon precursor m/z 347, proveniente da
ionização no modo positivo do nifedipino (NIF).
 143

Figura 30 - Espectro obtido após fragmentação do íon precursor m/z 475, proveniente da
ionização no modo positivo do sildenafila (SLD).

Figura 31 - Espectro obtido após fragmentação do íon precursor m/z 390, proveniente da
ionização no modo positivo da tadalafila (TAD).
 144

Figura 32 - Espectro obtido após fragmentação do íon precursor m/z 309, proveniente da
ionização no modo positivo da varfarina (VAR).

Figura 33 - Espectro obtido após fragmentação do íon precursor m/z 483, proveniente da
ionização no modo positivo do sildenafila d-8 (SLD d-8).
 145

Figura 34 - Espectro obtido após fragmentação do íon precursor m/z 455, proveniente da
ionização no modo positivo do verapamil (VERA).

Para a otimização dos parâmetros da fonte por FIA, utilizou-se uma solução de DGX
a 10 ng/mL em mistura de metanol e água 50:50 (v/v). A escolha da DGX nessa
etapa se deu pelo fato de ela ter sido o analito que apresentou menor intensidade de
sinal durante as etapas de otimização anteriores. Além disso, dentre os fármacos
analisados, ela é o que possui menor Cmax e, portanto, é necessário obter um LIQ
menor para ela. Os parâmetros de ionização da fonte otimizados são apresentados
na Tabela 37.

Tabela 37 – Parâmetros de ionização da fonte otimizados por FIA.

Gás de
Voltagem do Counter gas Temperatura da GS1 GS2
colisão
capilar (V) (psi) fonte (ºC) (psi) (psi)
(nível)
5000 20 médio 550 45 45

6.1.2 Otimização das condições cromatográficas

A primeira etapa do desenvolvimento do método cromatográfico consistiu na

definição da fase móvel. Para isso, foram testados diferentes eluentes aquosos,
como solução aquosa de ácido fórmico 0,01%, 0,05% e 0,1% (v/v); solução aquosa
de ácido fórmico 0,1% (v/v) com formiato de amônio 5 mM; solução aquosa de
 146

acetato de amônio 5 mM e 10 mM pH 5,5 e solução aquosa de formiato de amônio 5

mM e 10 mM pH 4,0. Como eluente orgânico testaram-se acetonitrila e metanol.

Uma vez que o método deve apresentar detectabilidade suficiente para quantificar
os analitos em plasma humano, optou-se por utilizar fase móvel constituída por
solução aquosa de ácido fórmico 0,1% (v/v) e acetonitrila, uma vez que foi a que
proporcionou maiores valores de razão sinal/ruído para todos os analitos.

Quanto à escolha da coluna cromatográfica a ser utilizada, observou-se que colunas

particuladas como as colunas cromatográficas Phenomenex Synergi Fusion C18 (50
x 2,0 mm, 4 µm) e Phenomenex Synergi Hydro C18 (50 x 2,0 mm, 4 µm) levaram à
formação de significativo efeito residual (carry over) para alguns analitos, como DTZ,
SLD e TAD. O efeito residual, também conhecido como carry over, refere-se ao
aparecimento ou aumento do sinal do analito devido a contaminação proveniente de
amostras analisadas anteriormente. É frequentemente observado com compostos
básicos, uma vez que os mesmos podem ser adsorvidos aos silanóis residuais
presentes na fase estacionária, ficando mais fortemente retidos e não sendo eluidos
durante aquela corrida cromatográfica. O efeito residual pode ser fonte de
imprecisão e inexatidão do método cromatográfico e, por isso, precisa ser eliminado
(SAKAMAKI et al., 2015).

Dessa forma, para tentar solucionar esse problema, além de testar diferentes
gradientes com força eluente maior, optou-se por testar uma coluna monolítica, a
Phenomenex Onyx Monolithic C18 (100 x 4,6 mm), a qual eliminou o efeito residual e
proporcionou picos com formato guaussiano. Ademais, ao injetar cinco vezes
consecutivas a mesma solução, demonstrou reprodutibilidade dos tempos de
retenção e das área sob os picos dos analitos.

A fase monolítica é um meio contínuo de separação (fase ou suporte contendo uma

"partícula única"), comumente em formato cilíndrico. Possui uma estrutura sólida e
altamente porosa, de pequenos domínios e canais relativamente grandes, que
fornecem altas permeabilidade e eficiência cromatográfica (FARIA et al., 2006). A
utilização dessa fase foi benéfica para solucionar o problema de carry over, que
ocorre comumente em métodos cromatográficos.
 147

Outro problema que deve ser contornado durante o desenvolvimento de um método

bioanalítico por HPLC-MS/MS, é a eliminação do efeito matriz, o qual acontece
devido à coeluição de componentes da matriz com os analitos de interesse,
interferindo dessa forma, na eficiência de ionização da fonte ESI, podendo provocar
efeitos de supressão ou indução iônica. Muitos mecanismos já foram propostos, mas
acredita-se que ocorre pela presença de substâncias não voláteis ou solutos menos
voláteis que mudam a eficiência da formação de gotículas ou a evaporação, o que
por sua vez, afeta a quantidade de íons carregados na fase gasosa que finalmente
atinge o detector. Dentre as hipóteses descritas, uma delas é que o composto
endógeno pode competir com os analitos pela carga ou pelo acesso à superfície das
gotículas para a transferência para a fase gasosa. Outra hipótese considera os
efeitos de um aumento na viscosidade e tensão superficial das gotículas provocada
pelos compostos interferentes, reduzindo a evaporação do solvente e a habilidade
do analito em atingir a fase gasosa (EECKHAUT et al., 2009; KING et al., 2000;
TAYLOR, 2005).

Grande parte das impurezas do plasma apresentam características polares e, dessa

forma, possuem menor retenção quando se utiliza coluna cromatográfica de fase
reversa, sendo então eluídos em menor tempo. Por isso, testaram-se diversos
gradientes, alterando-se as proporções dos eluentes aquoso e orgânico ao longo do
tempo, com o objetivo de se obter um fator de retenção superior a 1,5 (para que
ocorresse uma separação adequada entre os interferentes endógenos e os analitos
de interesse) e, ao mesmo tempo, garantir um tempo de corrida mais curto.

O gradiente definitivo (Tabela 33, página 127) proporcionou tempo de retenção do

primeiro analito (N-DMS) de 4,97 minutos e fator de retenção de 1,99. Para o re-
equilíbrio da coluna, testaram-se os tempos de dois a oito minutos e, concluiu-se
que cinco minutos eram suficientes para garantir tempos de retenção reprodutíveis
para todos os analitos. Os tempos de retenção e respectivos DPR para todos os
analitos são apresentados na Tabela 38.

Observa-se que os analitos eluem com tempos de retenção que variam entre 4,97 e
6,32 minutos. Ao utilizar a detecção por espectrometria de massas, cada analito é
monitorado por uma transição de massa distinta, não sendo necessário, portanto,
 148

obter separação a nível de linha de base entre os picos cromatográficos, o que

proporcionou um método de análise rápido.

Tabela 38 – Tempos de retenção médios obtidos para os 11 analitos utilizando-se as condições

cromatográficas otimizadas.
Tempo de retenção (tR)
Analito
(média  DPR)
ANLO 5,33  0,11
BUM 6,11  0,09
DGX 5,18  0,11
DTZ 5,24  0,11
N-DMS 4,97  0,20
NIF 6,19  0,09
SLD 5,04  0,11
TAD 5,85  0,17
VAR 6,32  0,09
SLD d-8 5,02  0,12
VERA 5,36  0,00

Outro importante parâmetro a ser otimizado em métodos por HPLC-MS/MS é o

Dwell Time. Um valor ideal de Dwell Time produz um pico cromatográfico com 15 a
20 pontos (SCIEX, MN.ST.004 rev.02). Para definir o Dwell Time para cada transição
monitorada, utilizou-se a equação apresentada no item 5.1.2, (página 126) e um
valor ideal de pontos igual a 15. Os valores de Dwell Time definitivos são
apresentados na Tabela 36 (página 139).

Por fim, avaliou-se a ocorrência de crosstalk, o qual pode ser observado quando se
utiliza o método de monitoramento de reações múltiplas (MRM) e os íons do
fragmento de uma transição monitorada são verificados durante a detecção de uma
outra transição. Esse fenômeno geralmente ocorre, pois os íons não são
completamente eliminados da região da célula de colisão quando a próxima
transição começa a ser monitorada. Esses íons são, consequentemente, associados
à transição errada. Dessa forma, métodos por HPLC-MS/MS rápidos, com limites de
quantificação muito baixos, ampla faixa de quantificação, principalmente, quando
são usados PI de isótopos deuterados e ocorre co-eluição de analitos que têm o
mesmo íon produto, podem ser afetados pela ocorrência de crosstalk. Esse efeito
pode ser eliminado definindo-se um atraso apropriado (tempo de pausa) entre as
transições monitoradas, longo o suficiente para limpar todos os íons do sistema
(MORIN et al., 2011).
 149

Considerando-se que os analitos N-DMS, SLD e SLD d-8 apresentam tempos de

retenção, estruturas químicas muito parecidas e, que, a partir de todos os íons
precursores analisados, foram formados os íons produto de razão m/z 283; 311 e
299, como pode ser observado nos espectros de fragmentação (Figuras 28, 30 e
33, páginas 142-144), realizou-se o teste para averiguar a existência de crosstalk,
que poderia interferir na precisão dos resultados, conforme descrito no item 5.1.2
(página 128). Foi utilizado um tempo de pausa (intervalo de tempo entre transições
monitoradas) de 5 milissegundos. Ao analisar o cromatograma da solução contendo
apenas SLD, observou-se que os sinais referentes às transições monitoradas para
N-DMS e SLD d-8 apresentaram o mesmo aspecto daqueles observados quando se
injetou a solução branco. Sendo assim, pode-se concluir que não ocorre crosstalk na
determinação desses analitos, ou seja, não há interferências no monitoramento de
transições de massas que apresentam o mesmo íon produto.

Na Figura 35 encontra-se o cromatograma obtido com a utilização das condições

cromatográficas e do gradiente do método otimizados, os quais estão descritos nas
Tabelas 32 e 33 (página 127), respectivamente.

Figura 35 – Cromatograma obtido a partir das condições cromatográficas otimizadas para a

determinação simultânea de ANLO, BUM, DGX, DTZ, N-DMS, NIF, SLD, TAD, VAR utilizando
SLD d-8 e VERA como PI.

O cromatograma foi obtido após extração de uma amostra de plasma branco fortificada com os
analitos na concentração correspondente ao nível 5 da curva de calibração (Tabela 35, página 134).
 150

6.1.3 Otimização da etapa de preparo de amostra

A última etapa do desenvolvimento do método bioanalítico consistiu em determinar

os parâmetros para extração dos analitos do plasma, de modo a obter um método
eficaz, reprodutível e que forneça soluções finais mais limpas quanto for possível.
Além disso, foi priorizada a utilização de uma técnica miniaturizada, a DLLME, na
qual são empregados pequenos volumes de amostra e de solvente.

Duas ou mais técnicas de preparo de amostra associadas são frequentemente

utilizadas quando se deseja aumentar a eficácia da extração. Conforme descrito na
revisão publicada por Saraji e Boroujeni (2014), dentre as estratégias para melhorar
a seletividade e a capacidade de limpeza da DLLME, muitos estudos descrevem a
realização de uma etapa prévia de PPT com um solvente adequado que,
posteriormente atuará como dispersante na DLLME.

Dessa forma, optou-se por realizar uma etapa de limpeza prévia da amostra por
meio do emprego da PPT, e o sobrenadante resultante foi usado como dispersante
na etapa subsequente da DLLME. Essa mesma sequência de procedimentos de
preparo de amostra foi realizada no estudo descrito por Jouyban e colaboradores
(2015), os quais desenvolveram um método por HPLC-UV para quantificação de
cinco fármacos antiarrítmicos em plasma humano.

A análise estatística do experimento univariado realizado para definir o melhor

agente precipitante levou à escolha de acetonitrila com hidróxido de amônio 0,1%
(v/v), uma vez que esse solvente promoveu maiores valores de área sob o pico, ou
seja, maior recuperação, para a maioria dos analitos.

Após a realização do CCD para a otimização das variáveis quantitativas referentes à

PPT, as recuperações obtidas os analito em cada um dos experimentos foram
inseridos no software Design Expert® e procedeu-se à interpretação dos resultados.
Não houve falta de ajuste ao modelo linear para nenhum dos analitos. Para os
analitos ANLO, BUM, DTZ e TAD a regressão do modelo matemático proposto foi
significativa e então foram obtidas as suas superfícies de resposta. Nas superfícies
de resposta apresentadas na Figura 26, foram plotadas as interações das variáveis
 151

que apresentaram efeito secundário mais significativo, enquanto a terceira variável

foi fixada em seu nível central.

Figura 36 – Superfícies de resposta obtidas para recuperação de ANLO (A), BUM (B), TAD (C) e
DTZ (D) durante a otimização da etapa de PPT usando planejamento CCD.

Ao analisar a Figura 36A, verifica-se que uma maior recuperação do ANLO é

alcançada quando é utilizado um menor volume de amostra e maior volume de
solvente precipitante. Já para a BUM (Figura 36B), a recuperação aumenta com a
utilização de uma menor proporção de volume do solvente extrator e menores
tempos de agitação. A recuperação de TAD (Figura 36C) é maximizada com a
utilização de menores volumes de solvente extrator e menor tempo de agitação. Por
fim, para o DTZ (Figura 36D), recuperações superiores são obtidas com uso de um
menor volume de amostra e maiores volumes de solvente extrator. Uma vez que,
para cada fármaco analisado ocorreu o direcionamento para condições ótimas
distintas, optou-se por utilizar a função desejabilidade, visando uma condição ótima
que proporcionasse a maximização das recuperações de todos simultaneamente.
 152

Os resultados obtidos para uma desejabilidade de 0,802, ou seja, os valores

considerados ótimos para maximizar a recuperação dos analitos, consistiram na
utilização de 100 µL de amostra (plasma), 200 µL do solvente precipitante
(acetonitrila com hidróxido de amônio 0,1% v/v) e tempo de agitação de 30
segundos.

Prosseguiu-se a otimização da etapa de preparo de amostra por meio sequencial e

univariado, determinando-se os parâmetros que influenciam na DLLME, conforme
apresentado nas seções a seguir.

6.1.3.1 Determinação do pH da fase aquosa (tampão)

Para se obter resultados de recuperação mais elevados, é recomendado ajustar o

pH da fase aquosa, de maneira a manter os analitos predominantemente na sua
forma não ionizada e, assim, aumentar sua afinidade pelo solvente extrator. Além
disso, considerou-se interessante utilizar uma solução tampão como fase aquosa,
objetivando-se resultados reprodutíveis.

Dessa forma, para a escolha do pH da fase aquosa, foram testados tampões na

faixa de pH de 2 a 10, sendo utilizados para isso, tampões fosfato pH 2, 7 e 8,
acetato pH 4, citrato pH 6 e etanolamina pH 9 e 10. As soluções tampão foram
preparadas a 100 mM e o ajuste de pH foi realizado com soluções de hidróxido de
sódio ou ácido clorídrico. Para que a força iônica (concentração de íons) não
interferisse na escolha do pH do tampão, a mesma foi padronizada, adicionando-se
quantidades adequadas de cloreto de sódio. Para a determinação da força iônica
utilizou-se a equação apresentada a seguir:

em que: I = força iônica; ci = concentração molar do íon (mol/L); zi = carga do íon.

Os resultados obtidos para a otimização do pH da fase aquosa a ser utilizada na

DLLME são apresentados na Figura 37.
 153

Figura 37 – Avaliação do pH do tampão a ser utilizado na DLLME.

 154

Verificou-se, experimentalmente (Figura 37), que para a BUM, os tampões pH 2 e

pH 4 proporcionaram maiores recuperações e, a partir do pH 6, há uma queda
drástica da sua recuperação, o que pode ser explicado observando-se o seu
diagrama de ionização ao longo da faixa de pH (Figura 38), no qual verifica-se que,
em valores de pH superior a 6, a BUM encontra-se, predominantemente, nas suas
formas ionizadas, não apresentando, portanto, muita afinidade pelo solvente
extrator, que possui característica apolar, sendo assim, menos extraída da fase
aquosa. Ao analisar o gráfico de log D predito em função do pH, apresentado na
Figura 22 (página 120), observa-se também que, valores máximos de log D para
BUM são obtidos em meios com pH entre 2 e 5,5. Em valores de pH maiores que 5,5
o log D começa a reduzir drasticamente.

Figura 38 – Diagrama de distribuição das formas ao longo da faixa de pH para a BUM.

Fonte: CHEMAXON, 2018.

Entretanto, a utilização de fases aquosas com valores de pH muito baixos,

promoveram reduzidas recuperações para SLD e N-DMS, uma vez que, como pode
ser observado na Figura 22 (página 120), os gráficos de log D predito em função do
pH desses analitos mostram que, em pH 2 e 4, ambos possuem log D negativo e,
portanto, encontram-se majoritariamente na forma ionizada, não tendo portanto,
afinidade pelo solvente orgânico, sendo por isso, pouco extraídos nessa condição.
 155

Já para o ANLO, valores de pH superiores a 8 proporcionam log D maior que 1,0

(Figura 22, página 120). Sendo assim, como observado experimentalmente (Figura
37), a utilização dos tampões pH 8, 9 e 10, proporcionaram os maiores valores de
recuperação para esse analito.

Como o método a ser desenvolvido deve permitir a extração de analitos que

apresentam diferentes características físico-químicas (principalmente log D e pKa),
optou-se por escolher o tampão citrato pH 6 como fase aquosa para a DLLME, uma
vez que a utilização do mesmo possibilitou recuperações não tão altas, mas
consideradas aceitáveis para ANLO e BUM, recuperações intermediárias para N-
DMS, SLD, DGX e DTZ, além de ter sido a melhor condição para NIF, TAD e VAR.

6.1.3.2 Determinação da concentração do tampão

O tampão escolhido na etapa anterior foi preparado e testado nas concentrações de

30, 50, 100, 150 e 200 mM. Assim como no teste anterior, para o preparo das
diferentes concentrações dos tampões, a força iônica também foi padronizada.

Os resultados obtidos para a otimização da concentração do tampão citrato pH 6 a

ser utilizado como fase aquosa na DLLME são apresentados na Figura 39.

Ao observar a Figura 39, é possível perceber que o tampão pH 6 na concentração

de 100 mM promoveu maior média da área sob o pico para a maioria dos analitos
(ANLO, BUM, DGX, DTZ, SLD e TAD). Inclusive, para o ANLO, que é um dos
analitos que apresenta menor Cmax. Por isso, definiu-se a utilização de tampão pH 6
100 mM na etapa de preparo de amostra por DLLME.
 156

Figura 39 – Avaliação da concentração do tampão a ser utilizada na DLLME.

 157

6.1.3.3 Determinação da força iônica do tampão

Para avaliar a influência da força iônica do tampão na extração dos analitos, testou-
se a utilização de solução tampão pH 6 100 mM preparado sem a adição de cloreto
de sódio e contendo 1%, 2%, 4%, 6%, 8% e 10% (p/v) desse sal.

A presença de sal na solução aquosa pode favorecer a extração dos analitos, uma
vez que, para analitos que são relativamente solúveis em água, o efeito salting-out
pode reduzir a solubilidade do mesmo em água.

O efeito salting-out pode ser definido como um fenômeno que ocorre quando a
concentração de sal em uma solução aquosa torna-se muito alta e, então, provoca
redução na solubilidade de moléculas orgânicas. Dessa forma, se essas moléculas
orgânicas são analitos parcialmente solúveis em água, ocorrerá uma redução
drástica da solubilidade dos mesmos na fase aquosa, fazendo com que aumente a
partição no solvente orgânico (TANG; WENG, 2013).

Ao verificar os resultados mostrados na Figura 40, percebe-se que a concentração

de cloreto de sódio não interferiu de forma muito significativa na extração dos
analitos de interesse. As concentrações 1% (p/v) e 10% (p/v) de cloreto de sódio
foram as que promoveram maiores valores de áreas sob o pico para a maioria dos
analitos. Entretanto, dentre essas duas concentrações, 1% (p/v) foi melhor para
ANLO e DGX, que são fármacos com baixos valores de Cmáx e também para N-
DMS, para o qual será necessário baixo limite de quantificação por se tratar de um
metabólito. Dessa forma, definiu-se a utilização de tampão pH 6 100 mM com cloreto
de sódio 1% (p/v) na DLLME.

O preparo do tampão pH 6 100 mM com cloreto de sódio 1% (p/v), escolhido como

fase aquosa do método de extração por DLLME, foi preparado pesando-se 1,1764 g
de citrato de sódio tribásico di-hidratado, 1,1526 g de ácido cítrico e 1 g de cloreto de
sódio em béquer de 100 mL. Adicionaram-se, em seguida, 90 mL de água e ajustou-
se o pH para 5,99 pela adição de solução de hidróxido de sódio 10% (p/v).
Transferiu-se para um balão volumétrico de 100 mL, completou-se o volume com
água e homogeneizou-se.
 158

Figura 40 – Avaliação da força iônica do tampão a ser utilizado na DLLME.

 159

6.1.3.4 Determinação do solvente extrator

Avaliou-se a extração utilizando-se diclorometano, clorofórmio, clorobenzeno e 1,2-

dicloroetano como solvente extrator.

A escolha de um solvente extrator apropriado é muito importante para a eficiência da

extração por DLLME. O solvente extrator deve apresentar os seguintes requisitos:
capacidade e seletividade de extração dos analitos de interesse em relação aos
componentes da matriz, baixa solubilidade em água, formação de pequenas
gotículas na presença do solvente dispersante, comportamento cromatográfico
adequado e uma densidade diferente da fase aquosa para tornar possível a
separação de fases (JOUYBAN et al., 2015; SARAJI; BOROUJENI, 2014).

Os quatro hidrocarbonetos halogenados testados nessa etapa apresentam as

características físico-químicas necessárias para atuarem como extrator na DLLME,
tais como baixa solubilidade e maior densidade que a água, conforme apresentado
na Tabela 39

Tabela 39 – Propriedades físico-químicas dos solventes extratores avaliados durante

otimização da DLLME.
Solvente Massa molar Solubilidade em Densidade
Fórmula química
extrator (g/mol) água (g/L, 20-25ºC) (g/cm3, 20°C)
Diclorometano CH2Cl2 84,93 20 1,33
Clorofórmio CHCl₃ 119,38 8,7 1,48
Clorobenzeno C₆H₅Cl 112,56 0,2 1,11
1,2-dicloroetano C₂H₄Cl₂ 98,96 7,9 1,25
Fonte: MERCK, 2020.

Como pode ser observado na Figura 41, a utilização do diclorometano proporcionou

valores de área sob o pico significativamente maiores para todos os analitos, com
exceção da DGX. Apesar de não ter sido o solvente que proporcionou maior área
sob o pico da DGX, o diclorometano proporcionou valores elevados de extração
deste analito e, portanto, foi o solvente extrator escolhido para a DLLME.
 160

Figura 41 –Avaliação do tipo do solvente extrator a ser utilizado na DLLME.

 161

6.1.3.5 Determinação do volume do solvente extrator

Para definir o volume de solvente extrator a ser utilizado, adicionaram-se diferentes

volumes (50, 75, 100, 125 e 150 µL) de diclorometano ao sobrenadante resultante
da etapa de PPT e então prosseguiu-se às etapas necessárias à DLLME.

O volume do solvente extrator tem efeito importante na eficiência da extração, uma

vez que volumes menores de extrator promovem aumento do fator de
enriquecimento (definido como a razão entre a concentração do analito na fase
extraída e concentração inicial do analito na amostra), devido à redução do volume
do sedimento e, além disso, devido à toxicidade da maioria dos solventes extratores,
o volume utilizado deve ser o mais baixo possível (SARAJI; BOROUJENI, 2014).

Na Figura 42 encontram-se os resultados obtidos. Para a maioria dos analitos, a

recuperação foi maior com a utilização de 100 µL ou 125 µL de solvente extrator.
Portanto, para que haja um menor consumo de solvente orgânico, optou-se por
utilizar 100 µL de diclorometano como solvente extrator.
 162

Figura 42 –Avaliação do volume do solvente extrator a ser utilizado na DLLME.

 163

6.1.3.6 Determinação do volume do tampão

Os resultados de áreas sob o pico obtidas para os analitos com o uso de diferentes
volumes de tampão (640, 760, 880, 1000 e 1100 µL) são apresentados na Figura
43. Optou-se por utilizar 880 µL de tampão pois, apesar de não ter sido a condição
que promoveu maior valor de área para todos os analitos, proporcionou menor DPR
entre as réplicas para todos os analitos, favorecendo assim, a reprodutibilidade do
método.
 164

Figura 43 –Avaliação do volume do tampão a ser utilizado na DLLME.

 165

6.1.3.7 Determinação do solvente dispersante

A seleção do solvente dispersante é baseada na sua miscibilidade em ambas as

fases aquosa (amostra) e orgânica (solvente extrator). Os solventes mais usados
como dispersantes são acetona, metanol e acetonitrila (SARAJI; BOROUJENI,
2014).

Até este momento do trabalho, a acetonitrila com hidróxido de amônio 0,1% (v/v),
utilizada como agente precipitante de proteínas, estava sendo empregada como
dispersante na etapa subsequente de extração por DLLME. Entretanto, optou-se por
testar se outros solventes usualmente aplicados como dispersantes em DLLME
seriam mais eficazes para recuperar os analitos da matriz biológica. Dentre esses,
testaram-se, além da acetonitrila com hidróxido de amônio 0,1% (v/v), metanol,
etanol e isopropanol.

A utilização de acetonitrila com hidróxido de amônio 0,1% (v/v) produziu uma boa
dispersão, por meio da formação de intensa turbidez no momento da adição da
mistura contendo amostra, dispersante e extrator na fase aquosa. Além disso, como
pode ser observado nos resultados apresentados na Figura 44, acetonitrila com
hidróxido de amônio 0,1% (v/v) resultou em maiores valores de área sob o pico e
valores de DPR adequados para a maior parte dos analitos e, portanto, optou-se por
manter a utilização desse solvente como dispersante.
 166

Figura 44 –Avaliação do solvente dispersante a ser utilizado na DLLME.

 167

6.1.3.8 Determinação do volume do solvente dispersante

O volume de solvente dispersante influencia diretamente a formação do sistema de

microgotas de água-solvente dispersante-solvente extrator, o grau de dispersão do
solvente na fase aquosa e, consequentemente, a eficiência da extração
(ANTHEMIDIS; IOANNOU, 2009; MARTINS et al., 2012).

O volume adequado de solvente dispersante para maximizar a formação das

microgotículas depende tanto do volume da fase aquosa quanto do volume do
solvente extrator (MARTINS, 2012). Por isso, apesar do volume de dispersante já ter
sido avaliado durante a otimização da etapa de PPT, após a otimização e
padronização dos volumes de fase aquosa e orgânica, optou-se por verificar se a
utilização de 150 µL e 300 µL, além dos 200 µL de solvente dispersante favoreceria
a recuperação dos analitos.

Como pode ser observado nos resultados apresentados na Figura 45, a utilização
de 200 µL de acetonitrila com hidróxido de amônio 0,1% (v/v) (solvente precipitante
e dispersante) foi a condição que promoveu a melhor recuperação para a maior
parte dos analitos. E, portanto, foi mantido esse volume de solvente
precipitante/dispersante.
 168

Figura 45 –Avaliação do volume do solvente dispersante a ser utilizado na DLLME.

 169

6.1.3.9 Determinação do tempo de agitação

Com o objetivo de favorecer a formação de gotículas do solvente extrator dispersas

na amostra e, consequentemente aumentar a eficiência de extração, após a etapa
de adição da mistura contendo os solventes dispersantes e extrator na fase aquosa,
testou-se agitar o microtubo de 2 mL em vórtex durante 30, 60, 120, 180 e 300
segundos a uma velocidade de 3000 rpm.

Ao analisar os resultados obtidos, apresentados na Figura 46, verifica-se que o

aumento do tempo de agitação em vórtex não proporcionou alteração representativa
na recuperação para a maioria dos analitos. Entretanto, para o ANLO, foi obtido um
maior valor de área média sob o pico quando utilizada agitação por 120 segundos.
Além disso, para BUM, TAD e N-DMS, o uso de 120 segundos de agitação
proporcionou aumento significativo da recuperação quando comparado com os
tempos de 30 e 60 segundos. Apesar de 300 segundos de agitação em vórtex ter
favorecido a extração de TAD e N-DMS, considerou-se que, se esse tempo fosse
escolhido, o preparo de amostra seria demorado e, portanto, optou-se por
padronizar a agitação em vórtex durante 120 segundos.
 170

Figura 46 – Avaliação do tempo de agitação em vórtex a ser utilizado na DLLME.

 171

6.1.4 Definição dos padrões internos (PI) e método DLLME otimizado

Em métodos bioanalíticos por HPLC-MS/MS deve-se utilizar um PI com o objetivo de

conseguir resultados com precisão e exatidão satisfatórios, uma vez que o PI se
destina a corrigir possíveis variabilidades e perdas que podem ocorrer devido aos
procedimentos envolvidos na etapa de preparo de amostra (diluição, evaporação,
degradação, recuperação, adsorção) e corrigir erros referentes à etapa de detecção.

O PI pode ser um isótopo ou um análogo estrutural do analito, com propriedades

físico-químicas semelhantes às do analito de interesse (STOKVIS; ROSING;
BEIJNEN, 2005). PI isotopicamente marcados são os preferidos para detecção por
espectrometria de massas, uma vez que são quimicamente idênticos ao analito,
apresentando apenas massas diferentes. Portanto, para a quantificação de SLD
optou-se por utilizar um isótopo deuterado do sildenafila, o sildenafila d-8 (SLD d-8),
como PI.

Para os demais analitos, foram testados propranolol, carvedilol, VERA e diazepam

como PI. Uma vez que a extração na DLLME se deve ao processo de partição do
analito entre a fase orgânica e aquosa, selecionaram-se substâncias que possuem
diferentes valores de log D predito em pH 6 (pH do meio onde ocorrerá a extração)
para serem testadas como PI. Como pode ser observado na Figura 22 (página 120),
em pH 6, os valores de log D para esses analitos são de, aproximadamente, -0,5
para propranolol, 0,8 para carvedilol, 1,6 para VERA e 3,0 para diazepam. Então
verificou-se qual dessas substâncias proporcionaria melhor reprodutibilidade dos
resultados. Os resultados obtidos encontram-se na Tabela 40.

Tabela 40 – Resultados de DPR da área sob o pico normalizada com a utilização de diferentes
substâncias como PI.
DPR da área sob o pico normalizada (%)
Analito
Propranolol Carvedilol VERA Diazepam
ANLO 22,87 10,10 7,24 16,18
BUM 18,30 12,48 6,31 17,99
DGX 15,18 8,89 2,94 19,16
DTZ 16,65 9,47 3,10 18,96
N-DMS 29,87 18,74 13,94 22,55
NIF 24,78 14,48 11,52 10,93
TAD 21,27 10,73 6,65 14,27
VAR 23,62 14,47 11,07 14,68
 172

O PI escolhido para os analitos (com exceção do SLD) foi o VERA, uma vez que o
DPR entre a razão da área dos analitos pela área do VERA em todas as cinco
réplicas proporcionou valores de DPR inferiores a 15% para todos analitos.

As etapas do método DLLME otimizado são apresentadas na Figura 47.

Figura 47 – Etapas do método DLLME otimizado.

Legenda: ACN = acetonitrila; NH4OH = hidróxido de amônio; NaCl = cloreto de sódio; PI = Padrões
internos.
 173

Portanto, a etapa de preparo de amostra por DLLME otimizada consistiu em

transferir 100 µL de plasma para microtubo de plástico de 1,5 mL. Em seguida,
adicionar 40 µL de solução metanólica de PI (contendo VERA a 52,5 ng/mL e SLD d-
8 a 250 ng/mL) e agitar em vórtex por 15 segundos. Acrescentar 200 µL de
acetonitrila com hidróxido de amônio 0,1% (v/v) (solvente precipitante e dispersante)
e homogeneizar em agitador do tipo vórtex por 30 segundos. Centrifugar durante 5
minutos a 9400 x g e 4 °C e transferir o sobrenadante para outro microtubo de 1,5
mL. Adicionar 100 µL de diclorometano (solvente extrator) e aspirar o conteúdo
desse microtubo com uma seringa de 1 mL e adicioná-lo rapidamente em um
microtubo de 2 mL contendo 880 µL de tampão pH 6 100 mM com cloreto de sódio
1% (p/v). Agitar em vórtex por 120 segundos, centrifugar por 5 minutos a 9400 x g e
4 °C e, em seguida aspirar com a mesma seringa, 120 µL do sedimento (fase
extratora, situada na parte inferior do microtubo). Transferir para um microtubo de
plástico e evaporar o solvente em concentrador de amostras. Ressuspender os
analitos com 50 µL de fase móvel, agitar em vórtex durante 30 segundos e transferir
para vial.

6.2 Validação do método bioanalítico

6.2.1 Seletividade

A seletividade do método bioanalítico foi demostrada extraindo-se quatro amostras

de plasma normal, uma amostra de plasma hemolisado e uma amostra de plasma
lipêmico.

Na Figura 48 são apresentados, como exemplos, os cromatogramas obtidos para

uma das amostras de plasma branco normal e para uma amostra de LIQ (destaca-
se que as escalas do eixo y são diferentes). Um dos objetivos da etapa de preparo
de amostra é eliminar os possíveis interferentes provenientes da matriz biológica.
Dessa forma, o método de preparo de amostra otimizado mostrou-se adequado.
Ademais, com a utilização da espectrometria de massas sequencial, a qual promove
maior seletividade ao método analítico, foi possível obter um método seletivo para
todos os analitos e PI.
 174

Figura 48 – Cromatogramas obtidos para uma amostra de LIQ (A) e uma amostra plasma
branco normal (plasma normal 1) (B) para avaliação da seletividade do método bioanalítico.
 175

Como pode ser observado na Tabela 41, em nenhuma das amostras de plasma
branco normal, hemolisado e lipêmico houve interferentes com tempo de retenção
próximo dos analitos de interesse com área superior a 20% da área do respectivo
analito no LIQ. Além disso, picos eluindo próximo ao tempo de retenção dos PI
apresentaram valor de área inferior a 5% das áreas dos PI, estando de acordo com
o preconizado nos guias de validação de métodos bioanalíticos nacional e
internacionais.

Tabela 41 – Porcentagem da área de picos interferentes em relação à área do analito de

interesse no LIQ.
Porcentagem da área de picos interferentes em relação ao LIQ (%)
Analito Plasma Plasma Plasma Plasma Plasma Plasma
normal 1 normal 2 normal 3 normal 4 hemolisado lipêmico
ANLO 0,19 10,25 7,37 8,31 3,17 3,68
BUM 8,02 9,69 8,55 8,02 8,84 8,93
DGX 1,12 5,99 8,94 0,87 4,08 5,27
DTZ 0,02 1,39 1,52 0,41 0,02 0,81
N-DMS 2,30 6,52 1,16 1,22 0,78 1,65
NIF 0,72 0,42 0,48 11,67 1,11 0,61
SLD 0,89 10,83 4,93 0,28 0,55 0,37
TAD 0,00 2,33 3,03 0,00 3,78 2,87
VAR 1,79 3,89 2,54 2,22 10,70 2,97
SLD d-8 0,00 0,03 0,00 0,00 0,00 0,00
VERA 0,11 0,12 0,12 0,11 0,19 0,09

6.2.2 Efeito residual

Com o objetivo de evitar a ocorrência de efeito residual, a lavagem da agulha do

injetor foi programada para ser realizada entre as injeções das amostras, com uma
solução de lavagem constituída por mistura de água, metanol e acetona (40:40:20
v/v) acidificada com ácido fórmico a 0,1% (v/v).

A ausência de efeito residual no método foi confirmada (Tabela 42), uma vez que
não foram observados, nas injeções de amostra branco subsequentes à injeção da
amostra de LSQ, picos interferentes com áreas superiores a 20% da área dos
analitos nas amostras de LIQ e maiores que 5% das áreas dos PI.
 176

Tabela 42 – Porcentagem da área de picos interferentes na amostra de plasma branco após

injeção da amostra de LSQ em relação à área do analito de interesse no LIQ para determinação
do efeito residual.
Área do pico interferente
na amostra de plasma Área do analito na
Analito Efeito residual (%)
branco após injeção da amostra de LIQ
amostra de LSQ
ANLO 2,91x103 2,68x104 10,86
BUM 7,98x10 3 8,31x10 4 9,61
DGX 4,15x102 3,56x103 11,64
DTZ 1,16x104 1,79x105 6,47
N-DMS 6,87x10 1 4,56x103 1,51
NIF 2,19x103 1,96x105 1,12
SLD 3,39x102 1,53x104 2,21
TAD 1,78x104 2,34x105 7,58
VAR 3,21x104 7,57x105 4,24
SLD d-8 9,93x102 2,93x106 0,03
VERA 7,96x104 4,82x106 1,65

6.2.3 Efeito matriz

Os resultados obtidos encontram-se na Tabela 43.

Tabela 43 - Avaliação do efeito matriz utilizando o FMN para as amostras provenientes do

preparo de amostra por DLLME e por PPT.
DLLME PPT
Analito Concentração
Média FMN DPR (%) Média FMN DPR (%)
CQB (3 ng/mL) 1,32 13,65 1,29 16,47
ANLO
CQA (80 ng/mL) 1,03 10,85 0,54 5,30

CQB (15 ng/mL) 1,30 8,15 0,34 71,39

BUM
CQA (400 ng/mL) 0,87 7,01 0,16 8,06

CQB (2,1 ng/mL) 1,49 14,43 0,63 32,02

DGX
CQA (24 ng/mL) 0,91 12,49 0,36 8,14

CQB (15 ng/mL) 1,17 4,64 0,70 14,28

DTZ
CQA (800 ng/mL) 1,07 5,98 0,63 8,13

CQB (3 ng/mL) 1,14 14,46 1,55 9,07

N-DMS
CQA (400 ng/mL) 1,19 10,42 1,06 20,42

CQB (15 ng/mL) 1,88 8,15 1,24 16,97

NIF
CQA (400 ng/mL) 1,00 8,11 0,63 8,00

CQB (15 ng/mL) 0,91 11,44 1,15 21,70

SLD
CQA (800 ng/mL) 1,03 3,13 1,34 4,43

CQB (15 ng/mL) 1,33 6,27 0,33 79,66

TAD
CQA (800 ng/mL) 1,00 11,08 0,17 6,37

CQB (75 ng/mL) 1,35 6,95 0,79 13,64

VAR
CQA (800 ng/mL) 0,83 6,19 0,56 10,36
 177

Percebe-se que os valores de DPR obtidos para todos os analitos, quando se utiliza
o preparo de amostra por DLLME, são inferiores a 15%, ou seja, abaixo do limite
preconizado nos guias vigentes e, por isso, o método analítico pode ser utilizado
para todas as amostras. Por outro lado, ao verificar os valores de DPR encontrados
para os analitos quando apenas a etapa de precipitação de proteínas é realizada, é
possível concluir que existe efeito matriz para todos os analitos, com exceção do
DTZ e VAR.

Ao observar a Figura 49, a qual apresenta os microtubos após a etapa de

evaporação do solvente extrator em concentrador de amostra, é visualmente
perceptível a diferença em relação à seletividade de extração quando se utiliza
apenas a PPT e quando é realizada, adicionalmente, a DLLME em uma mesma
amostra. Verifica-se que o microtubo proveniente da extração por PPT encontra-se
com muito mais sujidades provenientes do plasma do que o microtubo resultante da
DLLME. Além disso, é possível verificar também que, após ressuspensão, a amostra
oriunda da PPT encontra-se amarelada, enquanto aquela proveniente da DLLME é
translúcida.

Figura 49 – Microtubo após etapa de evaporação do solvente extrator proveniente da DLLME

(A) e PPT (B) e vial contendo amostra ressuspendida após procedimento da DLLME (A) e PPT
(B).

Sabendo-se que o efeito matriz é causado pela supressão ou indução de ionização

do analito por componentes da matriz biológica quando a espectrometria de massas
é empregada, é possível afirmar que o preparo de amostra utilizando DLLME foi
capaz de eliminar os interferentes que estavam causando efeito matriz, quando
apenas a etapa de PPT foi utilizada. Ressalta-se, portanto, a importância da
utilização de técnicas de preparo de amostra que sejam capazes de promover
seletividade ao método analítico.
 178

6.2.4 Linearidade

A definição da faixa de trabalho para cada um dos analitos foi realizada com base
nos dados disponíveis na literatura referentes a CMÁX, t1/2, dose diária recomendada
para o tratamento e dosagem das formulações disponíveis no mercado (Tabela 29,
página 119). Os LIQ e LSQ foram escolhidos de modo a garantir aplicabilidade do
método desenvolvido na monitorização terapêutica de fármacos utilizados no
tratamento da HAP, o que não exclui sua aplicação em amostras de pacientes que
apresentam outras doenças, cujos tratamentos incluem os mesmos tipos de
fármacos.

Ao analisar as amostras branco, não foram verificados picos de interferentes nos

tempos de retenção com áreas superiores a 20% das áreas dos analitos no LIQ e a
5% das áreas dos PI. As áreas dos PI nas amostras zero foram semelhantes
àquelas obtidas para as demais amostras das curvas de calibração.

Para as três curvas de calibração, os modelos matemáticos linear e quadrático foram

avaliados utilizando-se o software MultiQuant® e, nos casos em que a variância do
erro não foi constante em toda a faixa de quantificação do método analítico,
testaram-se diferentes fatores de ponderação (1/x; 1/x2; ln(x); 1/y; 1/y2 e ln(y)).

A escolha do modelo matemático mais simples foi realizada por meio do menor valor
obtido para a soma dos erros relativos dos valores nominais dos padrões de
calibração versus seus valores obtidos pela equação da curva.

Durante a avaliação dos resultados, aqueles pontos que apresentaram desvios em

relação à concentração nominal, acima do valor preconizado, foram excluídos,
sendo então desconsiderados na determinação da equação da reta.

As equações das retas e os respectivos coeficientes de determinação (R2) obtidos

são apresentados na Tabela 44. O modelo matemático mais simples, que promoveu
melhor ajuste e menor valor da soma dos erros relativos foi a regressão linear, com
fator de ponderação 1/x2 para todos os analitos, com exceção da DGX e N-DMS,
para os quais o fator de ponderação utilizado foi 1/x.
 179

Tabela 44 - Equações da reta e coeficientes de determinação obtidos para os analitos durante

avaliação da linearidade da faixa de trabalho.
Analito Curva de calibração Equação da reta R2
1 y = 2,87x10 x - 7,50x10
-3 -4
0,9933
ANLO 2 y = 3,23x10-3x + 1,13x10-4 0,9926
3 y = 4,49x10-3x + 4,11x10-4 0,9975

1 y = 1,21x10-3x - 4,05x10-4 0,9910

BUM 2 y = 2,41x10-3x + 2,40x10-3 0,9906
3 y = 2,77x10-3x + 3,57x10-3 0,9914

1 y = 3,91x10-4x - 1,39x10-5 0,9913

DGX 2 y = 6,92x10-4x - 3,55x10-4 0,9905
3 y = 7,22x10-4x + 1,93x10-4 0,9955

1 y = 3,72x10-3x + 7,69x10-3 0,9948

DTZ 2 y = 3,30x10-3x + 3,70x10-3 0,9941
3 y = 3,58x10-3x + 1,18x10-2 0,9959

1 y = 1,27x10-3x - 5,06x10-4 0,9941

N-DMS 2 y = 1,13x10-3x - 8,47x10-4 0,9968
3 y = 1,18x10-3x - 3,46x10-4 0,9959

1 y = 4,56x10-3x - 7,55x10-4 0,9935

NIF 2 y = 3,59x10-3x - 8,59x10-3 0,9910
3 y = 4,47x10-3x - 8,00x10-3 0,9848

1 y = 9,34x10-4x + 5,32x10-3 0,9983

SLD 2 y = 7,22x10-4x + 2,83x10-3 0,9926
3 y = 8,06x10-4x + 3,39x10-3 0,9931

1 y = 2,57x10-3x + 1,76x10-3 0,9962

TAD 2 y = 4,81x10-3x + 2,26x10-3 0,9917
3 y = 6,44x10-3x - 1,06x10-4 0,9967

1 y = 5,25x10-3x + 3,69x10-2 0,9907

VAR 2 y = 4,75x10-3x - 5,86x10-3 0,9887
3 y = 5,46x10-3x + 4,00x10-3 0,9895

As três curvas de calibração foram consideradas aprovadas, uma vez que,

apresentaram, no mínimo, 75% dos pontos (12 pontos) com desvios inferiores a
20% para o LIQ e 15% para os demais pontos, além de, no mínimo, seis níveis de
concentração, incluindo o LIQ e o LSQ, aprovados conforme os critérios de
aceitação descritos nos guias de validação.

Como exemplo, as curvas de calibração obtidas para todos os analitos no terceiro

dia de avaliação são apresentadas na Figura 50.
 180

Figura 50 – Curvas de calibração obtidas durante a avaliação da linearidade no terceiro dia de

análise.

ANLO BUM

DGX DTZ

N-DMS NIF

SLD TAD

VAR
 181

6.2.5 Precisão, exatidão e recuperação

Os resultados obtidos para a avaliação da precisão e exatidão intracorrida e

intercorridas, assim como os resultados obtidos de recuperação do método
bioanalítico são apresentados na Tabela 45.

Tabela 45 – Valores de DPR e EPR obtidos durante a avaliação da precisão e exatidão

intracorrida e intercorridas e recuperação do método bioanalítico.
Precisão (DPR%) Exatidão (EPR%) Recuperação
Analito Nível Intracorrida Intracorrida média (%)
Intercorridas Intercorridas (DPR %)
1º dia 2º dia 3º dia 1º dia 2º dia 3º dia
CQLIQ 4,41 4,76 8,87 7,20 14,18 7,10 3,24 8,17 -
CQB 6,76 10,80 2,82 8,24 3,27 -5,04 5,91 1,38 42,25 (5,10)
ANLO
CQM 10,41 8,59 4,69 7,80 0,58 -2,72 -1,46 -1,20 36,97 (12,92)
CQA 4,22 8,56 7,97 7,67 5,49 -3,19 -2,21 0,03 43,64 (13,35)
CQLIQ 11,08 7,72 7,49 8,96 5,48 2,51 -2,36 1,84 -
CQB 8,49 4,16 6,99 6,69 -3,20 1,80 -3,13 -1,51 22,53 (5,74)
BUM
CQM 5,40 5,96 3,26 7,41 5,02 2,66 -7,65 0,01 23,04 (8,16)
CQA 9,56 4,10 2,46 6,67 0,60 9,05 2,42 4,02 26,40 (11,56)
CQLIQ 8,11 9,78 5,88 7,55 4,15 3,13 2,00 3,09 -
CQB 9,21 8,17 9,70 8,86 4,07 -0,51 -2,65 0,30 51,73 (13,68)
DGX
CQM 3,23 10,71 8,79 8,27 8,35 -0,35 2,49 3,50 53,01 (13,28)
CQA 6,06 4,93 4,74 6,64 -1,19 9,31 7,74 5,29 58,11 (10,45)
CQLIQ 4,84 10,20 9,45 8,22 5,27 4,63 -0,34 3,19 -
CQB 5,86 6,76 8,74 6,97 -0,64 3,97 0,99 1,44 99,77 (6,54)
DTZ CQM 8,15 5,50 3,66 6,01 2,20 3,16 -1,50 1,29 89,98 (12,75)
CQA 6,29 6,35 7,34 6,28 3,04 5,54 3,38 3,98 99,63 (3,12)
CQD 4,70 3,77 6,75 5,09 3,94 7,95 5,31 5,73 -
CQLIQ 9,12 5,97 7,77 8,06 6,76 2,10 -2,01 2,28 -
CQB 6,75 7,97 8,53 7,94 4,81 -1,57 -2,71 0,18 43,12 (10,38)
N-DMS
CQM 4,28 11,88 6,99 7,80 2,95 -0,75 0,42 0,87 55,50 (10,04)
CQA 7,81 5,93 5,05 6,54 3,92 -1,49 4,82 2,41 44,25 (12,60)
CQLIQ 8,24 6,06 2,33 9,27 -5,03 -0,96 12,98 2,20 -
CQB 7,41 3,20 5,52 7,19 -4,86 -8,29 2,43 -3,57 50,96 (14,14)
NIF
CQM 7,30 6,11 5,48 7,56 2,17 -6,29 -7,63 -3,92 54,43 (5,03)
CQA 6,60 4,22 2,77 4,55 1,55 0,92 3,35 1,94 62,72 (13,76)
CQLIQ 1,34 12,25 2,03 6,84 -2,35 0,13 0,36 -0,61 -
CQB 3,84 4,11 6,04 4,91 6,68 1,59 5,45 4,57 86,47 (8,57)
SLD
CQM 5,58 10,18 2,54 7,65 -6,54 0,86 2,89 -0,93 85,82 (10,31)
CQA 4,21 9,66 9,41 7,70 4,67 3,33 0,56 2,85 93,74 (10,05)
CQLIQ 7,11 7,32 10,27 8,06 0,63 4,56 -1,03 1,39 -
CQB 7,77 4,79 7,65 6,49 5,43 2,83 2,89 3,72 63,38 (8,16)
TAD
CQM 4,54 3,88 8,90 6,69 6,81 2,69 -2,04 2,49 73,51 (8,72)
CQA 6,35 3,35 5,27 7,03 -2,71 10,01 2,01 3,11 71,95 (11,39)
CQLIQ 11,05 8,84 8,28 9,03 -0,23 4,15 5,20 3,04 -
CQB 2,54 5,21 7,17 8,59 -3,02 10,66 -4,71 0,98 66,12 (8,79)
VAR CQM 8,05 4,81 4,94 6,25 2,53 0,46 -3,35 -0,12 74,20 (9,36)
CQA 5,92 5,03 4,15 8,71 -7,81 6,30 -8,54 -3,35 61,34 (11,56)
CQD 8,95 3,76 7,07 7,01 2,51 8,09 1,15 3,92 -
 182

Ao analisar a Tabela 45, verifica-se que os valores de DPR foram inferiores a 20%
para o CQLIQ e a 15% para os demais CQ, e que os valores de EPR encontram-se
na faixa de ± 20% do valor nominal para o CQLIQ e ± 15% do valor nominal para os
demais CQ. Dessa forma, o método bioanalítico pode ser considerado preciso e
exato.

Durante a etapa de otimização do método de preparo de amostra, diferentes níveis

das variáveis que influenciam na extração por DLLME foram avaliados visando-se
uma maior extração dos analitos. Os resultados de recuperação obtidos mostram
que, apesar das recuperações médias não serem próximas a 100% para a maior
parte dos analitos, a reprodutibilidade do método é adequada, uma vez que o DPR
entre os valores de recuperação obtidos entre as cinco réplicas, em cada um dos
níveis de concentração avaliados, foi inferior a 15%.

6.2.6 Estabilidade dos analitos em plasma

Os resultados obtidos para as amostras de estabilidade referente aos estudos de

ECC, ECD, ELD e EPP são apresentadas na Tabela 46. Conforme pode ser
observado, os valores de EPR para todas as amostras encontraram-se na faixa de
±15% do valor nominal e, além disso, os valores de DPR obtidos foram inferiores a
15%. Esses resultados evidenciam que as amostras de estabilidade apresentam
exatidão e precisão adequadas e que os resultados das análises das amostras de
validação e de voluntários não sofrem alterações provenientes de uma possível
degradação dos analitos.

Tabela 46 – Resultados de exatidão (EPR) e precisão (DPR) obtidos para as amostras

provenientes dos estudos de estabilidade.
ECC ECD ELD EPP
Analito Nível Exatidão Precisão Exatidão Precisão Exatidão Precisão Exatidão Precisão
(EPR%) (DPR%) (EPR%) (DPR%) (EPR%) (DPR%) (EPR%) (DPR%)
CQB 5,86 1,17 10,11 4,79 0,04 4,73 3,79 3,61
ANLO
CQA 3,06 1,67 -0,61 4,51 7,19 4,59 -3,44 3,34

CQB -2,91 5,86 -0,13 -1,29 -1,18 6,29 9,58 10,30

BUM
CQA 14,95 3,45 4,50 6,80 2,49 4,78 -3,21 3,49

CQB 6,41 7,70 -3,30 7,26 5,63 11,14 10,73 7,43

DGX
CQA -9,17 11,60 6,99 2,69 2,33 5,72 -1,50 3,63
 183

Tabela 46 – Resultados de exatidão (EPR) e precisão (DPR) obtidos para as amostras

provenientes dos estudos de estabilidade (continuação).
ECC ECD ELD EPP
Analito Nível Exatidão Precisão Exatidão Precisão Exatidão Precisão Exatidão Precisão
(EPR%) (DPR%) (EPR%) (DPR%) (EPR%) (DPR%) (EPR%) (DPR%)
CQB 7,98 3,62 -1,31 10,40 2,07 7,69 1,00 8,20
DTZ
CQA 5,65 2,33 4,20 1,95 -1,24 5,64 -2,58 4,20

CQB 5,40 3,64 12,11 7,07 3,53 5,69 -1,31 11,84

N-DMS
CQA 0,63 1,86 7,01 2,78 4,87 2,73 -2,41 10,41

CQB 0,42 8,21 4,36 6,59 -4,27 9,12 -9,63 6,49

NIF
CQA 12,00 3,38 2,52 4,59 -1,53 4,51 -1,48 5,98

CQB 8,62 4,96 5,24 2,48 5,51 6,24 -5,98 10,15

SLD
CQA -0,40 4,38 4,15 8,67 5,47 5,67 1,93 10,72

CQB 4,58 6,93 2,76 6,83 -3,82 5,08 -2,67 6,59

TAD
CQA -2,36 3,94 -1,57 1,91 0,95 3,56 5,33 3,54

CQB 1,16 8,31 2,17 5,34 -5,91 7,21 4,64 14,74

VAR
CQA 0,33 4,04 2,29 5,78 9,67 4,26 1,85 2,38

6.3 Análise de amostras reais

As concentrações dos fármacos encontrados no plasma de pacientes voluntários

atendidos no Serviço de Anticoagulação, Hematologia e Oncologia do Hospital das
Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais são apresentadas na Tabela 47 e
os cromatogramas obtidos para as amostras de plasma dos voluntários 2 e 7, a título
de exemplificação, são apresentados na Figura 51.

Infelizmente não se tem informações a respeito da posologia do tratamento dos

pacientes voluntários e não se sabe o horário no qual os medicamentos foram
administrados antes da coleta de sangue. Dessa forma, torna-se inviável discutir a
respeito das concentrações plasmáticas encontradas. No entanto, é possível
verificar que foram encontrados nas amostras reais os fármacos ANLO, DTZ e VAR.
Para todas amostras analisadas, o DPR das concentrações plasmáticas obtidas
entre as três réplicas analisadas foi inferior a 15%, o que evidencia a adequabilidade
do método bioanalítico desenvolvido e validado.

Estava previsto no projeto submetido e aprovado pelo COEP (protocolo CAAE

65767617.9.0000.5149) a administração de SLD a voluntários, para que, o método
desenvolvido e validado pudesse ser aplicado na determinação de SLD e N-DMS
 184

em amostras reais. Entretanto, essa etapa não pôde ser realizada até o momento,
devido às restrições decorrentes do isolamento social necessário ao controle da
pandemia de COVID-19.

Tabela 47 – Concentrações plasmáticas obtidas em plasma de pacientes voluntários atendidos

no Serviço de Anticoagulação, Hematologia e Oncologia do Hospital das Clínicas da
Universidade Federal de Minas Gerais.
Concentração plasmática
Voluntário Fármaco DPR (%)
média (ng/mL)
1 DTZ 382,21 9,18

ANLO 11,77 9,24

2
VAR 782,32 14,93

3 VAR 619,13 14,45

ANLO 2,75 13,43

4
VAR 965,57 1,06

5 VAR 789,65 2,96

6 DTZ 544,44 7,95

DTZ 356,07 7,49

7
VAR 548,83 5,55

8 VAR 784,71 3,37

ANLO 13,04 9,25

9
VAR 729,18 13,59

10 VAR 452,68 12,63

Figura 51 – Cromatogramas obtidos na análise da amostra de plasma dos pacientes 2 (A) e 7

(B).
 185

7 CONCLUSÕES

Um método bioanalítico multifármacos, moderno, eficaz e que emprega HPLC-

MS/MS e preparo de amostra miniaturizado por DLLME foi desenvolvido e validado
para a quantificação simultânea de SLD, TAD e mais seis fármacos presentes nos
protocolos terapêuticos para HAP (ANLO, BUM, DGX, DTZ, NIF e VAR), além do
metabólito N-DMS, em plasma humano.

As etapas de desenvolvimento do método analítico consistiram na otimização dos

parâmetros do espectrômetro de massas, da fonte de ionização, definição das
transições de massas a serem monitoradas e das condições cromatográficas.

Na etapa de preparo de amostra, diferentes fatores que afetam o procedimento

DLLME, como pH, concentração, força iônica e volume da fase aquosa, tipo e
volume dos solventes dispersante e extrator, além do tempo de agitação foram
investigados e otimizados. O método de preparo de amostra miniaturizado,
apresentou-se seletivo e reprodutível. Além disso, são necessários pequenos
volumes de plasma (100 µL) e de solventes orgânicos.

A validação do método foi realizada de acordo com os guias nacional e

internacionais vigentes e os resultados foram satisfatórios para seletividade, efeito
residual, efeito matriz, linearidade, precisão, exatidão, recuperação e estabilidade
dos analitos em plasma. A faixa de trabalho contemplou concentrações de 0,7 a 30
ng/mL para DGX ,1 a 100 ng/mL para ANLO, 1 a 500 ng/mL para N-DMS, 5 a 500
ng/mL para BUM e NIF, 5 a 1000 ng/mL para SLD e TAD, 5 a 1500 ng/mL para de
DTZ, e 25 a 3000 ng/mL para VAR.

O método desenvolvido e validado se mostrou adequado e reprodutível na

determinação de fármacos em amostras de voluntários, podendo assim, ser
empregado na rotina de laboratórios de análises de fármacos e metabólitos em
plasma humano para monitorização terapêutica.
 186

CONSIDERAÇÕES FINAIS

No Capítulo I, a fim de determinar SLD, TAD e seus potenciais produtos de

degradação simultaneamente em medicamentos originais e ilegais, foi apresentado
um detalhado estudo de degradação forçada, no qual os IFA foram submetidos a
condições ácida, neutra, alcalina, oxidativa, calor, luz e presença de íons metálicos.
A seguir, um método simples e rápido utilizando UHPLC-UV e coluna com partículas
superficialmente porosas foi desenvolvido e validado para quantificação de SLD e
TAD na presença de seus produtos de degradação. As estruturas químicas e
mecanismos de formação para os principais produtos de degradação foram
propostas com base nos espectros obtidos por UHPLC–MS/MS.

O método por UHPLC-UV foi então aplicado na avaliação da qualidade de

medicamentos originais e apreendidos pelas autoridades policiais brasileiras para a
verificação das características farmacêuticas dos medicamentos aos quais a
população está tendo acesso.

No Capítulo II foi descrito o desenvolvimento de um método bioanalítico a ser

aplicado na monitorização farmacêutica de pacientes com HAP. O método
contemplou a quantificação simultânea de TAD, SLD, N-DMS e mais seis fármacos
presentes no protocolo da HAP (ANLO, BUM, DGX, DTZ, NIF e VAR) em plasma
humano, utilizando uma técnica de preparo de amostra miniaturizada e
ambientalmente correta, a DLLME, e HPLC-MS/MS para separação e detecção dos
analitos.

Portanto, conclui-se que os objetivos pretendidos foram alcançados, uma vez que
foram desenvolvidos, validados e aplicados métodos modernos, simples, rápidos,
ambientalmente corretos e eficientes na determinação de SLD e TAD em
medicamentos e em plasma humano.
 187

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 203

APÊNDICE A – Artigo publicado no Journal of Chromatographic Science -

https://doi.org/10.1093/chromsci/bmaa073.
 204

APÊNDICE B – Artigo publicado na revista Química Nova -

https://doi.org/10.21577/0100-4042.20170565 (trabalho em colaboração).
 205

APÊNDICE C – Artigo publicado no Journal of Pharmaceutical and Biomedical

Analysis - https://doi.org/10.1016/j.jpba.2020.113403 (trabalho em colaboração).
 206

APÊNDICE D – Artigo publicado no Current Pharmaceutical Analysis - DOI:

10.2174/1573412914666180730123426 (trabalho em colaboração).
 207

ANEXO A – Certificados de apresentação e de Relevância Acadêmica na XXVII

Semana de Iniciação Científica / PRPQ (Semana do Conhecimento UFMG 2018).
 208

ANEXO B – Certificado 1 de apresentação na sessão de pôsteres do III

Simpósio Nacional em Ciências Farmacêuticas (SINCIFAR – 2018).

ANEXO C – Certificado 2 de apresentação na sessão de pôsteres do III

Simpósio Nacional em Ciências Farmacêuticas (SINCIFAR – 2018).
 209

ANEXO D – Certificado de apresentação na sessão de pôsteres do IV

Congresso of the Brazilian Association of Pharmaceutical Sciences (ABCF
Congress - 2018).

ANEXO E – Certificado de apresentação na XXIX Semana de Iniciação

Científica / PRPQ (Semana do Conhecimento UFMG 2020).