High Throughput Solubility Analysis; a Tailored Approach to Supporting Drug Discovery Efforts 

Charles E. Taylor, Robyn A. Rourick and John P. Walsh 
Kalypsys, Inc. Pharmaceutical Sciences Department  10420 Wateridge Circle, San Diego, CA 92121 

Introduction/Abstract  Experimental  Optimization  Output and Metrics 

Figures  5a  and  5b: 
Purpose:  Solubility  is  a  widely  utilized  assay  throughout  the  Drug  Discovery  1.  Buffer Expansion Work  Ketoconazole Solubility Assay Metrics
96 Well   Graphs  illustrating  six 
projects at Kalypsys.  To increase the throughput, reduce the resource 
170 uL 10mM DMSO Stock  • Test multiple buffers used in various groups  1 Manual 1
replicate  calibration 
45

cost  and  maintain  the  credibility  of  the  current  assay,  we  aim  to  0.8 BioA 1

deploy a completely automated modified shake‐flask solubility assay  • Must be automation capable   0.6 Profiler 1

Profiler 2
curves  for  the  respective  40

Phosphate   DMSO 

AU
0.4
that is capable of analyzing various buffer types.     Profiler 3 compounds,  which  were  35
10 µL  46µL  Baseline   Intertwined   0.2 Profiler 4
Buffer  Automation  High Std. Dev. 
Buffer  Calibration   0 Profiler 5 constructed  by  the  fully 
  Capable  Of Samples  Absorbance  Profiler 6 30
Absorbance  0 100 200 300 400 500 600
automated method.  Also 

Compounds
Methods: Using a modified shake flask method, a medium throughput plate‐ 96 Well   Phosphate Buffer  Saline  Pass  Pass  Pass  Pass 
96 Well   in  the  graphs  are  a  25

based method was developed and qualified against literature values.   PBS (pH 7.4)  Pass  Pass  Pass  Pass  Concentration [uM]

Filterplate  Deepwell Plate  w/ 20% Acetonitrile  manually  prepared 
This method employed a filter plate as the shake vessel; allowing for  DMEM (‐phenol red)  Pass  Fail  Fail  Fail  Verapamil 20

(Samples)  (Calibration)  DMEM (‐phenol red) + 5% FBS  Fail  Pass  Fail  Fail  calibration  curve  and  a 
ease  of  post‐agitation  precipitate  filtration.    Calibration  gradients  in  RPMI (‐phenol red)  Pass  Pass  Fail  Fail 
1.5 Manual 1 15

BioA 1 s e m i ‐ a u t o m a t e d 
an organic mixture of the buffer allow for quantification of the sample  RPMI (‐phenol red) + 5% FBS  Fail  Pass  Fail  Fail  1 Profiler 1
Shake  Serial     Dilution  calibration  curve.    This  10

solubility.    UV  plates  were  used  to  read  both  the  sample  and  HBSS + 20mM Hepes  Pass  Pass  Pass  Pass  Profiler 2

AU
0.5 Profiler 3 graphs  illustrate  the 
4.5 Hrs  CYP450 Assay Buffer  Pass  Pass  Pass  Pass 
calibration  solution  absorbances;  the  latter  provides  for  a  linear  Legend  Profiler 4 5

@ 200RPM  Met. Stab. Assay Buffer  Pass  Pass  Pass  Pass  0 Profiler 5 capability  of  the  fully 
correlation of the UV absorbance to concentration.   Profiler 6 0
Process  ADB Kinase Buffer  Pass  Pass  Fail  Pass  0 100 200 300 400 500 600
automated  method  in 

7‐Aug‐05

7‐Aug‐06

7‐Aug‐07
7‐Jun‐05

7‐Jun‐06

7‐Jun‐07
7‐Apr‐05

7‐Apr‐06

7‐Apr‐07
7‐Dec‐05

7‐Dec‐06
7‐Feb‐05

7‐Feb‐06

7‐Feb‐07
7‐Oct‐05

7‐Oct‐06

7‐Oct‐07
  Step  Magic Buffer for Neutrophils  Pass  Pass  Pass  Pass  production. 
Initially,  this  procedure  was  performed  manually  with  multichannel  Magic Buffer 2  Pass  Pass  Pass  Pass  Concentration [uM]
Filter @ 
pipettes with the user taking the plates to various instruments.  The  Table  2:    Summary  of  the  Pass/Fail  results  for  the  various  buffers  in  the  system.    The  3.  Informatics Tools 
0.45 µM  Stock Plate 
automation  capable  category  considers  the  success  with  which  the  buffer  was  Figure  10:  Bar  chart  showing  the  historical  use  of  the  solubility  assay.    The  effect  of 
next  evolution  automated  the  liquid  handling  on  a  disposable  tip 
handled by the Tecan liquid handler and/or shaker.  A High Standard Deviation of 
• Queuing system  introducing  a  fully  automated  solution  provides  that  many  FTE  hours  will  be 
liquid‐handler.    In  this  configuration,  the  assay  was  expanded  to 
UV Plates 
the  samples  is  indicative  of  a  ruggedness  problem  for  inter‐  or  intra‐day  • Curate results  saved, and the use of the assay will increase with the throughput.    
include  analysis  in  multiple  buffer  types;  all  buffers  used  in  the  96 Well   reproducibility.  A failure in the baseline absorbance category would occur if the 
company were investigated for solubility analysis compatibility.    Shallow Well  buffer  system  showed  a  chromophore  of  significant  enough  intensity  to  affect  • Automated PDF report generation and archival 
Acetonitrile 
  Process Plates  the  current  quantitation  limits.    Intertwined  calibration  absorbance  curves  are 
often a result of a poorly behaving UV solvent with compound. 
The  next  design  iteration  was  to  increase  the  assay  throughput; 
Buffer Solubility Comparison Ketoconazole Solubility
achieved  by  migrating  the  assay  to  an  integrated  platform  and  40µL  160µL  200µL  Solvents  Verapamil Solubility
700 Figure  3:  Chart  illustrating  the 
upgrading the data handling tools for the assay.  A liquid handler with 
600 different  solubility  values 
the  accessories  capable  of  processing  the  solubility  assay  was  500 obtained  for  each  of  the 
96 Well   96 Well   Transfer 
installed;  this  system  allowed  for  a  theoretical  throughput  of  84 

Concentration [uM]
Volume 
400 buffers  tested.    Ketoconazole 
compounds  in  5  hours.    With  the  data  quantity,  a  server  based  data  UV Plate  UV Plate  300 is  represented  by  the  blue 
200
handling  package  was  needed  for  the  purpose  of:  a  sample  queuing  bars,  and  Verapamil  is 
100
system,  requesting  test  articles  from  compound  management,  represented  by  the  yellow 
0
bars.    The  validated 
parsing  raw  data  files,  curve  fitting,  outlier  sample  exclusion  and  UV Plate Read  -100 Figure  6:  User curate ability  Figure 7: Incoming sample queue. 

S
phosphate  buffer  replicates, 

es
)

)
FB

r
FB
1

4
ils
ed
4)

ed

ffe

2
e

f fe

fe
ep
e

e
ph
7.
lin

lr

lr

Bu
at

at

at

at
uf
5%

r
5%

Bu

fe
H
no
Sa

tro
H

no
automated report generation.   

B
Pl

Pl

Pl

Pl
Setup  10 minutes  10 minutes  10 minutes 

uf
-200

M
(p

y
260nm to 500nm  in Solubility Manager 

he

se
)+

he

eu
y
)+
B

B
sa

B
0m

a
S

A
a
s
(-p
which  were  used  as  controls, 

-p

N
As

ic
ed

ed
PB

/O

/O

/O
As

in
2

ag
I(

or
/

K
lr

lr
EM

AB

AB

AB

AB
+

y
PM

M
rf
no

lit
no

B
S

45

bi
U

U
fe
AD
M

BS
he

he
R

ta
P

uf
D

Y
 

(-p

-p

S
H

B
are boxed in red. 

C
Sample 

I(

ic

ic
EM

ol
PM

ag
ab

M
M

R
20 minutes  5 minutes  N/A 

et
D

M
Results:  The assay was successfully migrated to the fully automated platform,  Figure  1:  Illustration  showing  the  effect  of 
Buffer Systems
Plate Prep 
Effect of Shake Time in Sample 
with the capability of analyzing solubility in multiple buffer types.  The  Values shake  time  on  the  sample  results.    4.5  2.  Fully Automated Assay  Cal Plate 
data  handling  tools  were  successfully  implemented.    Each  method  hours  was  chosen  because  it  provides  3 hours   40 minutes  N/A 
3.5

3 most  of  the  compounds  enough  time  to 

• Validate the use of a liquid handler with specific automation  Verapamil
(28 Cmpds) 
developed  was  qualified  by  performing  a  parallel  analysis  in  the  4.5 Hrs 
AU
2.5
reach  equilibrium.  The  compounds  used  components:  Sample 
previous method(s); the assay was deployed only after qualification.    of 
2
in  the  illustration  were:    clozapine, 
20 minutes  10 minutes  N/A 
1.5
A.  Robotic Arm  Analysis 
  Samples 1
t a m o x i f e n ,   k e t o c o n a z o l e , 
0.5 Data  
Conclusions: The deployment of this assay, with its versatility and throughput  0
chlorpromazine,  chloramphenicol,  B.  Shaker  Verapamil

1 hour  15 minutes  15 minutes 

0.00 7.00 14.00 21.00 28.00 35.00 42.00 49.00 56.00 63.00 70.00 furosemide, 2‐naphthoic acid and 4,5‐DPI  Analysis 
has greatly impacted the Discovery efforts at Kalypsys.  Hours of Shaking C.  Vacuum Block    4 hours 40 minutes  1 hour 20 minutes  25 minutes 
Figure  8:  Sample  results  page  (from  left  to  right);  pass/fail  indicator,  tabulated  results, 
Objectives  Conc. (µM)  500  500  200  200 
Organic Buffer (µL)  285  285  380  380 
50  50  12.5  12.5  3.13  3.13 
285  285  285  285  285  285  285  285 
0  0  D.  UV Plate Reader  triplicate spectra, calibration spectra, calibration curve, structure, compound ID,  Figure  11:  FTE time dedicated to the assay at the various levels of development for a typical 
plate barcode, and well location.  run size of 28 compounds.  The data analysis time for the manual method is higher 
• Expanded assay to include multiple buffer solutions being used in‐house 
DMSO(µL)      12  12  15  15  15  15  15  15  15  15 
10 mM stock (µL)   15   15  8   8                  as that method was deployed before the Informatics Tools were deployed.  
• Fully automated solubility assay  Transfer (µL) from           100  100                   B 
Col 3& 4  
→ Robotic plate movement  Transfer (µL) from              100   100         
Acknowledgements 
D 
Col 5& 6  
C  The authors would like to thank the following individuals for their time and effort 
→ Automated plate reading  Transfer (µL) from                  100  100     
in  bringing  this  assay  to  deployment  and  optimizing  it  for  higher  throughput: 
• Server based data handling 
Col 7& 8 

Table  1:  Liquid  aliquots  and  serial  dilution  volumes  used  in  constructing  the  calibration 
Mike Calcagno, Qiner Yang, Frank Balistrieri , Chris Peterson and Katie Belsky. 
→ Queuing system integrated with proprietary “Request System”  concentrations used to determine the unknown sample concentrations.  Organic buffer  Figure  9:  From  the  results  displayed in Figure 7,   automatically generated PDF reports  Document Number  Description 
→ Curve fitting tools  refers  to  the  20%  Acetonitrile  composition  in  the  buffer  being  used  to  construct  the  are  created    and  archived  in  a  Solubility  Report  Library  on  the  company  AC_M T_Solubility_v1  Semi‐Auto and Manual Solubility Assay 
AC_HT_Solubility_v1  Fully Automated Solubility Assay 
calibration  curve.    Acetonitrile  helps  to  maintain  the  higher  concentrations  of  the  Figure  4:  Bed  layout  of  the  robotic  deck  that  is  used  to  process  the  fully  automated  intranet.    The  results  are  also  maintained  in  an  Oracle®  table,  which  can  be 
→ Automated report generation and archival  AC_MT_Solubility_Expansion_v1  Multiple Buffer System Validation 
compound in the calibration curve.  solubility assay.  data mined or displayed in SAR tables.    AC‐MethDev‐2006‐012v1  Fully Automated Solubility Assay Development