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 MATERIAL DO CURSO

INTRODUÇÃO À CITOLOGIA

APOSTILA

ESTUDO DO MICROSCÓPIO
ESTUDO DO MICROSCÓPIO

O nome "microscópio" (pequeno mikrós e skoppéoo para observação ponto a ponto)

pertence a Jean Faber, membro da antiga Academia de LINCEI (1624). Este vocábulo
refere-se a um microscópio que consiste em uma objetiva e uma lente ocular. Embora
na prática expandiu para todas as ferramentas de extensão simples e complexos.

O microscópio é um instrumento que permite observar objetos imperceptíveis a olho nu.

Isso é feito usando um sistema óptico que consiste em lentes de cristal. que quando
contrastado com a imagem do objeto para ampliar a imagem. De acordo com o número
e a posição da lente um microscópio simples (lupa = estereomicroscópio) e um
microscópio composto são diferentes.

Denominamos qualquer lente que amplia objetos com ou sem montagem própria, grande
ou pequena, biconvexa ou planoconvexa, de microscópio simples. É comumente referido
como uma lupa. Existem muitos modelos e modelos.

Qualquer lente convergente usada para formar uma imagem virtual e, portanto, qualquer
lente convergente direta e maior que o objeto, pode ser chamada de microscópio
simples. As lupas diferem apenas na montagem. Seu funcionamento é muito simples e
praticamente consiste em orientar a lente de forma que sua face plana ou menos
convexa fique voltada para o objeto e colocá-la a uma distância tal que ele (o objeto)
fique entre o foco e o ápice e mais próximo disso quanto maior for a imagem desejada.

UM MICROSCÓPIO COMPOSTO CONSISTE EM DOIS SISTEMAS DE LENTES

JUNTOS

Convergência: Perto do olho do observador, é chamado de sistema ocular e funciona

como um microscópio comum. O outro próximo ao objeto é chamado de sistema objetivo.
Este é realmente um microscópio. que chegamos em todos os laboratórios.

Com modelos simples é possível obter boas ampliações e fazer excelentes observações,
pois, exceto para estudos muito especializados, que exigem altas ampliações, um
microscópio comum será suficiente para passamos horas muito agradáveis e nos
permitirá observar qualquer classe de materiais. Ressaltemos que, não importa quantas
e diferentes sejam suas lentes, qualquer que seja sua potência, o princípio é sempre o
mesmo: basta colocar a lente objetiva de modo que o objeto seja colocado um pouco
além do foco principal da lente, mas o mais próximo possível para que a imagem formada
seja real e tão grande quanto possível, embutindo a ocular de forma que a imagem real
obtida pela objetiva fique entre o ápice e o foco da ocular, será obtida uma imagem virtual
direta e maior que a primeira. Consequentemente, a imagem do objeto virtual é notada
invertida e muito ampliada.
Quanto maior a curvatura das lentes e quanto maior a distância entre o sistema objetivo
e o sistema ocular, maior a ampliação total.

Assim, vemos que o microscópio composto possui dois sistemas de alargamento: a

ocular e a objetiva. Consequentemente, para calcular o alargamento total do
microscópio. Devemos multiplicar o alargamento do objeto pelo alargamento da ocular.

Ocular: Esta é uma lupa. O mais simples tem duas lentes e um diafragma interno. Dentro
do visor há uma lente de campo. O diafragma e a própria ocular.

OBJETIVAS: Formadas por múltiplas lentes. Grande parte da resolução alcançada e da

qualidade da imagem final depende da lente objetiva.

Existem vários tipos de lentes que diferem em qualidade de imagem, correção de

aberrações e preço.

TIPOS DE OBJETIVAS

1. Os acromáticos são os mais simples. Estes não são tão sofisticados quanto os
microscópios convencionais.

2. Semi-monocromáticos - também são chamados de fluorita, pois esta substância está

incluída em sua composição, o que proporciona alguma correção de aberração.

3. Monocromático - possui ampla correção. Ele cobre todo o espectro.

4. Planocromático - Imersão com ampliação de 63X e abertura numérica de 1,4, você

aufere a maior resolução de um microscópio ótico.

Objetivas de imersão: objetivas de alta ampliação que usam a abertura numérica total
da lente usando óleo de imersão. O óleo tem um índice de refração tal que impede que
os relâmpagos de luz sejam refletidos ao passar pelo material para o ar contido entre a
tampa e a lente objetiva.

Condensador: Consiste em várias lentes internas. O objetivo é focar a lente para que o
assunto obtenha um cone cheio de luz. Diafragma de abertura ajustável.

ILUMINAÇÃO COM UM MICROSCÓPIO ÓPTICO

Iluminação: Por transparência, o objeto observado é fino o suficiente para permitir a

passagem da luz. Uma lâmpada ou espelho traz luz do fundo do microscópio através do
condensador, objeto e objetiva. Existe um microscópio onde a luz vem do mesmo lado
da lente isso é chamado de epi-iluminação.

A luz utilizada: Pode ser natural, mas o mais comum é uma lâmpada de filamento de
tungstênio. Emite uma luz quase branca (levemente amarelada).

Para alcançar a mais alta resolução com um microscópio, basta seguir os técnicos de
iluminação de Kohler. O que fazer a seguir?

1. Feche o diafragma de abertura e focalize-o movendo o condensador. Uma imagem

facetada aparecerá.

2. Centralize a imagem acima.

3. Abra a abertura até que o campo fique igualmente brilhante.

MÉTODO DE OBSERVAÇÃO MICROSCÓPICA ÓPTICA

1. CAMPO CLARO

2. campo Escuro

3. CONTRASTE de fase

4. CONTRASTE INTERFERENCIAL

5. Polarização

6. brilho

7. Microscópio revertido

8. Microscópio ESTEREOSCÓPICO

9. Confocal a laser

1. CAMPO CLARO

Todos os microscópios trabalham com campos claros. usado para observar materiais
contaminados. Eles geralmente estão localizados entre a placa de vidro e a tampa.
2. CAMPO ESCURO

Este é um microscópio que usa um capacitor especial. Como a luz é dobrada, ela não
atinge o alvo diretamente. A luz atinge o material e apenas a parte desviada pelo objeto
penetra no alvo formando a imagem. O fundo é limpo e o material é brilhante. Se não
houver objetos, o campo fica completamente escuro. Esta técnica microscópica é usada
para materiais muito pequenos que são muito transparentes e têm muito pouco contraste
para serem observados em áreas claros.

3. CONTRASTE DE FASE

De acordo com o princípio físico de difração da luz. Este microscópio está equipado com
um sistema óptico especial que transforme a diferença de fase do feixe na diferença de
intensidade. Assim, as diferenças de fase às quais o olho não é sensível tornam-se
visíveis à medida que são traduzidas em diferenças facilmente perceptíveis na
intensidade da luz. As estruturas celulares aparecem escuras (fase positiva) ou
brilhantes (fase negativa) usando microscopia de contraste de fase.

4. CONTRASTE DE INTERFERÊNCIA

Muito útil quando se trabalha com materiais muito espessos devido ao contraste de fase,
ou quando se deseja visualizar pequenos detalhes de células sem coloração, cujo halo
de contraste de fase ocasiona alterações na imagem.

5. POLARIZAÇÃO

É utilizada na observação de materiais birrefringentes (estruturas anisotrópicas, com

diferentes índices de refração como músculos, ossos, celulose, fibras, cabelos, cristais,
etc.). Um microscópio polarizador possui dois prismas: um polarizado e outro analítico.

Quando a luz entra na estrutura acima mencionada A luz será dividida em duas partes.

O prisma permite que uma das vibrações de luz passe, mas não a outra, de modo que a
estrutura isotrópica se cancela e se torna mais escura. A estrutura birrefringente
(anisotrópica) cria uma espécie de vibração da luz que trespassa por ela. Apenas as
estruturas birrefringentes aparecerão brilhantes, com o resto do material escuro.
6. FLUORESCÊNCIA

Este microscópio é semelhante ao convencional, exceto que possui um sistema de

iluminamento e conjunto de filtros diferenciados – um que filtra a luz antes que ela atingir
o material e outro que filtra a luz emitida por ele. A amostra a ser estudada deve ser pré-
marcada com um composto fluorescente. Apenas a luz emitida pelo objeto é observada,
então ele tem um fundo claro e preto. O microscópio óptico fluorescente trabalha com o
sistema de luminescência. epi-iluminação.

7. MICROSCÓPIO INVERTIDO

Permite observar materiais muito espessos que não podem ser vistos por outros
microscópios. Permite observar as células dentro dos tubos e frascos, sem a
necessidade de abri-los, evitando assim problemas de contaminação.

8. MICROSCÓPIO ESTEREOSCÓPICO

Possuem uma ocular (lupa) que amplia o material, permitindo a visualização de

espécimes de necropsia.

9. LASER CONFOCAL

Possui uma série de particularidades que permitem a observação de material espesso,

sem coloração, vivo ou não, pois incide em diferentes planos focais, obtendo cortes
óticos. Em geral, ele funciona com o mesmo sistema óptico da fluorescência
convencional, mas no LSM todo o campo é iluminado, enquanto no LSM o sistema óptico
foca apenas os pontos em uma determinada profundeza da amostra. Diferença uma. É
necessária uma fonte de luz muito forte e brilhante, e é por isso que o laser é usado. A
luz do laser brilha através de um pequeno orifício. e ilumina um único ponto na amostra.

O material fluorescente emitido é coletado e enviado ao detector, que possui um segundo

pequeno orifício. Então a última imagem que podemos obter é a imagem tirada pelo
segundo buraco.
LIMITE DE RESOLUÇÃO X NÚMERO DE ABERTURAS

O limite de resolução é a distância mais curta entre dois pontos onde eles ainda podem
ser distinguidos separadamente. Assim, o poder de resolução do microscópio
corresponde aos limites de resolução mais baixos possíveis. Então,

d = K x * N.A.

Onde K é a constante (0,61) * é o comprimento de onda usado e N é.A é o número de

aberturas da lente. Consequentemente, ao usar um microscópio, você deve definir
imediatamente o número de abertura de suas objetivas, pois o melhor microscópio é
aquele que terá o maior número de abertura, pois seu limite de resolução será menor.

RESOLUÇÃO

A resolução é inversamente proporcional ao limite de resolução. O melhor microscópio

é aquele com a maior resolução.

O limite de resolução do olho humano é de cerca de 0,2 mm. Os melhores microscópios

ópticos têm um limite de resolução de 0,2 mm. Quanto menor o comprimento de onda,
melhor a resolução.

MICROSCÓPIO ELECTRÓNICO

A relação entre os limites de resolução e o comprimento de onda da radiação luminosa

é verdadeira para todas as formas de radiação. Ou um feixe ou um electrão. No entanto,
para elétrons, o limite de resolução pode ser muito pequeno. O comprimento de onda
dos elétrons ameniza com o aumento da velocidade. Em um microscópio electrónico a
uma voltagem acelerada de 100.000 V, o comprimento de onda do electrão é 0,004 nm.
Teoricamente, esses microscópios têm uma resolução de cerca de 0,002 nm, que é
10.000 vezes melhor que os microscópios ópticos.

No entanto, porque as aberrações das lentes eletrônicas são mais difíceis de corrigir do
que as aberrações das lentes de vidro. A resolução da maioria dos microscópios
eletrônicos modernos nas melhores condições é de 0,1 nm. Além disso, problemas de
preparação de amostras, contraste e danos por radiação limitam efetivamente a
resolução normal para materiais biológicos a 2 nm. No entanto, este valor é cerca de 100
vezes melhor do que a resolução do microscópio de luz.
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO (TEM)

O microscópio eletrônico de transmissão é semelhante ao microscópio óptico, mas muito

maior e de cabeça para baixo. A fonte de luz é um filamento ou cátodo que emite elétrons
do topo de uma coluna cilíndrica com cerca de 2 metros de altura. Como os elétrons são
espalhados por colisões com moléculas de ar, o ar deve primeiro ser bombeado para
fora da coluna para criar um vácuo. Os elétrons são então acelerados do filamento pelo
anodo e através dos minúsculos orifícios, criando um feixe de elétrons que viaja ao longo
da coluna. Bobinas magnéticos, colocadas ao longo do eixo, aproximam-se do feixe de
elétrons da mesma forma que as lentes de vidro encontram a luz em um microscópio
ótico.

A amostra é colocada no vácuo através de uma câmara de compressão no caminho do

raio de elétrons. Com relação à microscopia de luz, neste caso, as amostras são
geralmente coradas com materiais eletrodensos, conforme descrito na próxima seção.
Alguns dos elétrons que atravessam a amostra são espalhados pelas estruturas coradas
com material denso aos elétrons o restante é convergido para formar uma imagem de
forma análoga ao processo de formação de uma imagem no microscópio óptico em uma
placa fotográfica ou em uma tela fosforescente. Devido ao fato de os elétrons disperso
se desviarem do feixe, as regiões densas da amostra são destacadas como áreas de
fluxo reduzido de elétrons, as quais se mostram escuras.

COLORAÇÃO NEGATIVA

Permitem a visualização de macromoléculas com auto resolução. Apesar de

macromoléculas isoladas, como DNA ou proteínas, de alta massa molecular, podem ser
prontamente analisadas ao microscópio eletrônico, se elas forem sombreadas com metal
para produzir contraste, detalhes mais minuciosos podem ser vistos utilizando-se
coloração negativa. As moléculas, sustentadas por um filme delgado de carbono (o qual
é praticamente transparente aos elétrons), são lavadas com uma solução concentrada
de sal mais pesado com acetato de uranila.

Após amostra secar, uma camada muito fina do sal do metal cobre completamente o
filme de carbono exceto no local onde está localizada a amostra. Devido ao fato de as
macromoléculas permitirem a passagem dos elétrons, muito mais facilmente do que a
coloração de metal pesado circundante, uma imagem oposta ou negativa da molécula
criada. Coloração negativa é especialmente útil para observação de grandes agregados
de macromoléculas, como no caso dos vírus ou dos ribossomos e para visualização da
estrutura da sub unidade dos filamentos de proteína.

Sombreamento e coloração negativa são capazes de produzir uma visão de superfície

de alto contraste de pequenos agrupamentos de macromoléculas, mas ambos são
limitados em termos de resolução devido ao tamanho da menor partícula do metal
utilizado, tanto no caso do sombreamento quanto na coloração empregada.

MICORCÓPIO ELETRÔNICO DE VARREDURA

FUNCIONAMENTO

O SEM - Microscópio Eletrônico de Varredura - utiliza os elétrons que são emitidos da

superfície de amostra. A amostra a ser examinada é fixada, desidratada e coberta com
uma camada fina de metal pesado. A amostra é varrida por um feixe de elétrons. O
trajeto do feixe de elétrons é, em seguida, modificado por um conjunto de bobinas
refletoras que o fazem percorrer o espécimen ponto a ponto e ao longo de linhas
paralelas (VARREDURA). Ao atingirem o espécimen, os elétrons causam diversos
efeitos. Emitem elétrons secundários que são colhidos pelo coletor, passam por um
sistema de amplificação e são transformados em pontos de mais ou menos
luminosidade.

As micrografias são obtidas por fotografia da imagem na tela.

UTILIZAÇÃO

Obter imagens tridimensionais de superfícies.

MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE CRIOFRATURA

FUNCIONAMENTO

As células são congeladas à temperatura do nitrogênio líquido (-196 C) e depois

fraturado com uma lâmina de bisturi. O corte do plano da fratura tenta mostrar o interior
da membrana celular.

UTILIZAÇÃO

Possibilita uma forma de visualização do lado interno das membranas celulares.

MICROSCOPIA CRIOELETRÔNICA

FUNCIONAMENTO

Uma camada muito fina (~ 100 nm) de uma amostra hidratada rapidamente congelada.
Um prendedor de amostra e necessário para manter esta amostra hidratada a -160 C
no vácuo do microscópio, onde está pode ser observada diretamente, sem fixação,
coloração ou secagem.

UTILIZAÇÃO

Visão de estruturas internas tridimensionais de vírus por exemplo.

CONCLUSÃO

Os conhecimentos sobre as células progridem à medida que as técnicas de investigação

se aperfeiçoam. O aparecimento de um novo instrumento de trabalho, ou a aplicação
mais engenhosa de um aparelho já existente, leva sempre a novas descobertas e a
elucidações de algumas funções celulares.

Muitas técnicas de microscopia óptica estão disponíveis para a observação de células.

Células que foram fixadas e coradas podem ser estudadas em um microscópio óptico
convencional, enquanto anticorpos acoplados a corantes fluorescentes podem ser
usados para localizar moléculas específicas nas células em um microscópio de
fluorescência.

O microscópio confocal de varredura proporciona secções ópticas finas, e pode ser

usado para reconstruir uma imagem tridimensional, células vivas podem ser observadas
em contraste de fase, contraste de interferência diferencial, ou óptica de campo escuro.
Todas as formas de microscopia óptica são facilitados por técnicas de processamento
eletrônico de imagens, que ampliam e retiram a imagem.

O advento do microscópio eletrônico e seu emprego para estudos morfológicos e

citoquímicos representam enorme impulso para o conhecimento das funções celulares,
como na determinação da estrutura detalhada das membranas e organelas na célula.
Imagens tridimensionais da superfície das células e tecidos podem ser obtidos por
microscopia eletrônica de varredura, enquanto o interior da membrana e células podem
ser visualizados por técnicas de criofraturas e criodecapação respectivamente.
A influência do microscópio eletrônico foi tão grande que levou a uma revisão completa
nos conceitos morfológicos dos constituintes celulares. Atualmente, a forma e a estrutura
das organelas são geralmente descritas conforme aparecem no microscópio eletrônico.

O emprego conjunto das técnicas modernas, incluindo a radioautografia, a cultura de

células em meios nutritivos definidos, o emprego da microscopia de fluorescência, do
microscópio eletrônico de varredura, das técnicas de criofratura e das técnicas
bioquímicas, veio ampliar de tal maneira o estudo da célula. Que se tornou usual
designar essa nova abordagem sob a Biologia Celular e Molecular através da
microscopia.
REFERÊNCIA

BRASIL ESCOLA, Monografias. Microscópio. Disponível em:

http://monografias.brasilescola.uol.com.br/medicina/microscopio.htm. Acesso:
27/07/2023.
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